血细胞源性TFmRNA及血浆Fib水平与肢体动静脉血栓的研究

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作者单位：350001 福建医科大学省立临床医学院

通讯作者：陈群

【摘要】 目的 研究肢体动静脉血栓患者体内血细胞源性组织因子（TF）mRNA的表达及血浆Fib水平。方法 采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法对动脉血栓组、静脉血栓组患者及对照组成员外周血血细胞组织因子进行检测，并用全自动血凝仪分析血浆Fib水平。结果 动脉血栓组、静脉血栓组TF mRNA水平明显高于对照组，差异具有统计学意义（P

【关键词】 血细胞； tfmrna； Fib； 肢体动静脉血栓

Study of bloodcell TFmRNA and plasma Fib level in patients with arterious or venous thrombus LIU Yu-cheng,CHEN Qun, SHEN Xiao-li.Provincial Clinical Colleage of Fujian Medical Univercity,Fuzhou 350001,China

【Abstract】 Objective To investigate bloodcell TFmRNA and plasma Fib level in patients with arterious or venous thrombus.Methods Detect the bloodcell TFmRNA of the patients with arterious or venous thrombus and control group by means of RT-PCR and analyze the plasma Fib level for them by full automatici-coagulometer.Results The expression of TFmRNA in the blood of the patients with arterious or venous thrombus were significant higher than that of the control group（P

【Key words】 Bloodcells; TFmRNA; Fib; Membra thrombus

组织因子（TF）是一种跨膜糖蛋白，通过与凝血因子Ⅶ相互作用参与凝血过程，在动静脉血栓形成过程中起重要作用。另外，TF通过介导多种信号转导，参与肿瘤侵袭、转移，血管新生，动脉粥样硬化，炎症等病理、生理过程［1］。人组织因子可位于各种正常的组织细胞、血管内皮、血管壁及循环血中。而循环血中TF主要来源于血细胞。经典凝血学说认为，只有在血管壁破损时,内膜下TF暴露、释放才能启动凝血及血栓形成［2］。而对循环血中组织因子与血栓关系的研究较少。血浆fib增高是血栓形成的一个危险因素，血栓患者血浆Fib含量往往升高。本研究就循环中血细胞内的TF及其内TFmRNA表达和血浆Fib水平与肢体动静脉血栓关系进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2009年12月～2010年12月福建省立医院住院，经动、静脉造影确诊的肢体动、静脉血栓患者60例，其中动脉血栓组30例，静脉血栓组30例。另外，选取同期于本院体检的30例健康者作为对照组。所有入选患者的性别、年龄、血压、血小板、血糖及血脂构成比均无统计学意义，具有可比性。

1.2 入选标准及排除标准 入选标准：参照1995年中国中西医结合学会周围血管疾病专业委员会制定的诊断标准。排除标准：肿瘤、严重感染、DIC、严重肾衰、脑梗脑血栓、代谢性疾病及其它免疫性疾病患者。

1.3 方法 （1）采血：清晨用肝素锂真空采血管采取肘前静脉血5 ml，反复颠倒采血管数次。（2）去除红细胞：采取血标本2500 r/min离心后，去上清，加入红细胞裂解液进行红细胞裂解，洗涤、分离所需血细胞（白细胞、血小板）。（4）引物由上海生工生物工程有限公司合成。（5）提取总RNA：按照说明书，trizol一步法提取血细胞总RNA。（6）逆转录：RT试剂盒购自promega公司，按试剂盒说明进行逆转录，得到cDNA。（7）PCR反应：取cDNA产物1 μl，10 mM上下游引物各1 μl，2×Master Mix 12.5 μl，加水至25 μl，反应体系置PCR仪中进行扩增。（8）凝胶电泳分析、半定量分析。（9）STAGO STA全自动血凝仪检测血浆Fib水平。

1.4 统计学处理 所有实验数据均应用SPSS 13.0软件进行分析，实验数据以均数±标准差（ x±s）表示，两组均数比较用t检验，P

2 结果

2.1 动静脉血栓组TFmRNA表达情况 通过RT-PCR反应，DN段电泳，根据maker观察TF片段及GADPH片段大小分别为283 bp、400 bp。与对照组相比，动静脉血栓组TFmRNA表达量显著升高，差异具有统计学意义，见表1。

表1 三组血细胞内TFmRNA表达水平比较

注：与对照组相比，*P

2.2 血浆Fib水平 采取肘静脉血5 ml，离心，收集上层血浆，用法国STAGO STA全自动血凝仪对血浆Fib水平进行检测，结果见表2。

表2 三组血浆Fib水平比较

注：与对照组相比，*P

3 讨论

在体内，生理性止血与血栓形成的凝血过程几乎都是通过组织因子（TF）与FVIIa形成复合物而启动的。因此，对TF的研究已成医学科研的热点［3］。传统的凝血学说认为，只有在血管内皮细胞破坏、受损的情况下，内皮下、血管平滑肌层及血管外膜的组织因子暴露，与FVIIa结合启动生理性凝血或病理性血栓形成［4］。近来有学者实验证实，血液循环中的组织因子，几乎全部来自于血细胞，且主要以白细胞为主，在血栓的启动、形成及延续阶段起着至关重要的作用［5］。本研究以血栓患者及对照组成员静脉血血细胞为研究对象，从mRNA水平研究TF的表达情况。

国内外研究表明，TF表达与血栓性疾病关系密切。Blann等［6］研究发现，外周动脉血栓患者血浆中组织因子水平较对照组升高。大量报道证实，冠状动脉粥样硬化患者较健康对照组同样具有组织因子表达上升。国内外对TF与冠心病血栓形成的研究较多，研究发现，在血管内皮细胞、单核细胞和平滑肌细胞等动脉粥样硬化斑块中的这些主要细胞成分都能合成TF，这些TF一方面与平滑肌表面VIIa因子结合，激活ERK1（2）通路，从而引起血管重构；另一方面，TF有促进动脉粥样斑块内血管生成，使得斑块不稳定性增加，破裂脱落后导致更多的TF释放入血，引发血栓形成。且不稳定性心绞痛患者TF血浆水平要高于稳定性心绞痛患者，这就为TF在肢体动脉硬化患者中表达增高并促进血栓形成提供了有力的依据。Yuko Kamikura等［7］研究表明，静脉血栓形成患者，白细胞组织因子mRNA表达较健康自愿者升高，静脉血栓合并癌症或DIC患者，mRNA表达升高更加明显，同时，静脉血栓患者血浆中TF抗原水平显著升高。血细胞表达或血浆中TF水平增高原因主要有：（1）动脉粥样斑块破裂，斑块内TF释放及内皮下TF暴露、释放入血；（2）促炎症因子、凝血酶、内毒素、LDL、CRP等对血细胞，其中主要为单核细胞的诱导性表达。另外，单核细胞通过与内皮细胞、血小板及血管平滑肌细胞相互作用，促使其表达上调；（3）某些严重疾病，特别是严重感染、实体癌、造血系统肿瘤等［8］。本研究在排除严重感染，肿瘤等疾病的情况下，发现血栓患者血细胞组织因子mRNA表达较对照组明显增高，差别有统计学意义，表明血细胞高表达TF与血栓性疾病发生相关。而动静脉组之间比较，差别则无统计学意义（P0.166）。Nigel Mackman等［9］人指出，由于静脉血栓患者血管壁往往是完整的，因此MP TF（血细胞来源）在血栓形成中占主导地位，而动脉血栓形成中，斑块中TF起主要启动作用，MPTF只是在血栓延续过程中起作用。这也说明，血细胞TF表达增高在血栓形成中起着重要作用，并与血栓性疾病密切相关。

血浆纤维蛋白原（Fib）是血凝检测的筛选指标，也是血栓性疾病临床治疗效果的评估指标。血浆纤维蛋白原含量与血栓形成、粥样斑块破裂发生率成正比［10］。Renner等［11］认为，血浆Fib水平与深静脉血栓发生的危险性具有相关性。本研究无论动脉血栓还是静脉血栓组，血浆Fib水平均较健康对照组高，差异具统计学意义。但动静脉血栓组之间Fib水平差异则无统计学意义（P0.509）。

目前对血栓患者主要采取抗凝，抗血小板及溶栓治疗。本研究结果显示，血栓组血细胞内TF表达显著增高，说明血细胞性TF与肢体动静脉血栓疾病相关。另外，鉴于TF在动静脉血栓形成的过程及机制的不同，选择性使用抗TF药物，并结合抗血小板、溶栓等其它抗血栓治疗，能起到较为满意的治疗效果。目前对血细胞源性TF在血栓形成中的具体作用机制有待于进一步研究完善，这将为今后抗血栓治疗提供一条新的思路。

参 考 文 献

［1］ 方峻,宋善俊.组织因子的非凝血功能.中华血液学杂志，2004,25（3）：234.

［2］ 黄细莲,陈方平.血细胞源性组织因子的研究现状.中华内科杂志，2007，46（1）：23.

［3］ 胡静，王宏健，申晓辉，等.组织因子研究的若干进展.血栓与止血学，2008，14（3）：125.

［4］ Davie EW.Biochemical and molecular aspects of the coagulation cascade.Thromb Haemost,1995,74:1-6.

［5］ Peter LA.Giesen，Ursula R，Bernd B,et al. Blood-borne tissue factor: Another view of thrombosis. PNAS, 1999：2311-2315.

［6］ AD Blann，J Amiral，CN Mc Collum. Differences in free and total tissue factor pathway inhibitor, and tissue factor in peripheral artery disease compared to healthy controls.Atherosclerosis，2000，152：29-34.

［7］ Yuko Kamikura, Hideo Wada，Tsutomu Nobori,et al.Elevated levels of leukocyte tissue factor mRNA in patients with venous thromboembolism. Thrombosis Research,2005,116（4）:307-312.

［8］ Tomohiro Sale，Haideo Wada，Junji Nishioka，et al.Measurement of tissue factor messenger RNA levels in leulocytes from patients in hypercoagulable state caused by several underlying diseases.Thrombosis and Haemostasis，2003，89（4）：660-665.

［9］ Nigel Mackman，Rachel E Tillety，Nigel S Key. Role of the Extrinsic Pathway of Blood Coagulation in Hemostasis and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007，27:1687-1693.

［10］ Mauriello A,sangiorgi G.Hyperfibrinogenemia is associated with specific histocytological composition and complications of atherosclerotic carotid plaques in patients affected by trasient ischemic attacks.Circulation,2000,7:744.

［11］ Renner W,Cichocki L,Forjanics A.G-455A polymorphism of the fibrinogen beta gene and deep vein thrombosis.Eur J Chn Invest,2002,32（10）:755.

（收稿日期：2011-03-28）