HPLC法同时测定大籽獐牙菜中10种化学成分

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摘 要：建立反相高效液相色谱法同时测定大籽獐牙菜中10种成分的含量。方法：采用反相高效液相色谱，色谱条件为：Agilent XDB C18柱（Φ4.6×150 mm，5 μm）；流动相A：甲醇，B：水；洗脱方法：0～20 min，A为10%～30%，20～45 min A为30%～80%梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min，检测波长254 nm，230 nm，柱温28 ℃。结果：10种成分均达到基线分离，各化合物的线性关系良好，r>0.999 5；各待测物的精密度RSD值均小于1.1%；重复性良好（RSD

关键词：反相高效液相色谱；大籽獐牙菜；酮；环烯醚萜

中图分类号：R286.0 文献标识码：A 文章编号：1007-2349（2011）04-0064-02

大籽獐牙菜（Swertia macrosperm a C. B.Clark）系龙胆科（Gentianaceae）獐牙菜属（Swertia）植物，主要产于、贵州、云南等省［1］，獐牙菜属植物多具有清肝利胆、清热除湿等功效，在民间不少地方用该属植物治疗黄疸型肝炎。张媛媛等［2］对大籽獐牙菜化学成分进行了研究，该植物中酮类、环烯醚萜类成分具有广泛的生理活性。酮类化合物具有很好的保肝、降血糖、抗氧化等作用［3~6］，裂环烯醚萜苷中的龙胆苦苷可明显降低血清转氨酶、促进肝脏的蛋白质合成，还能促进胆汁及胃液的分泌，兴奋中枢神经系统，獐芽菜苦苷具有解痉、镇痛、镇静的活性，能促进毛发生长。此外，龙胆苦苷和獐芽菜苦苷均可促进细胞胶原质的产生以及有丝分裂活动，加快创口愈合速度［7~9］。对獐牙菜属植物中齐墩果酸、龙胆苦苷、獐芽菜苦苷及酮含量的hplc测定报道较多，杨慧玲等［10］对大籽獐牙菜中7种有效成分进行了测定。本试验建立了对大籽獐牙菜中10种成分的高效液相色谱的含量测定方法，为评价药材质量及合理用药提供了可靠依据。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪，配置为自动进样器、高压四元梯度泵、DAD检测器、Agilent1200色谱工作站；Agilent XDB-C18柱（Φ4.6×150 mm d，5 μm）色谱柱；AS20500A超声波清洗器；超纯水仪。流动相用甲醇为色谱纯（美国Tedia公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。断马钱子苷半缩醛内酯（S1）、表断马钱子苷半缩醛内酯（S2）、獐芽菜苷（S3）、龙胆苦苷（S4）、芒果苷（S5）、1O葡萄糖基2，3二氢1，4，6，8四羟基酮（S6）、1，3，5，6四羟基酮（S7）、2'O（3羟基苯甲酰基）獐芽菜苦苷（S8）、3，3'双（3，4二氢4甲氧基6羟基2H1苯并吡喃）（S9）、1甲氧基3，7二羟基酮（S10）10种标准对照品均由本课题组制备，纯度均在98%以上。植物样品于2009年11月采自云南省玉溪市新平县，经云南中医学院杨礼攀博士鉴定为龙胆科獐牙菜属植物大籽獐牙菜。样品阴干后粉碎过80目筛，室温下保存，植物标本存于云南民族大学民族药资源化学重点实验室标本馆。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent XDB-C18（Φ4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇和水在0～20 min内由10∶90至30∶70、20～45 min内由30∶70至80∶20梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，230 nm，柱温28 ℃。在该色谱条件下10种成分均达到基线分离。

2.2 对照品储备液的配制 精确称取对照品S1 2.1 mg、S2 2.6 mg、S3 1.5 mg、S4 7.1 mg、S5 9.4 mg、S6 1.1 mg、S7 6.5 mg、S8 5.9 mg、S9 4.3 mg、S10 5.3 mg分别置10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成相应浓度的对照品储备液。

2.3 样品溶液的制备 精确称取粉碎至80目的待测样品3份，每份1.000 g，分别加入40.00 mL甲醇置80 ℃水浴中索式提取75 min，提取后采取体积补偿，过0.45 μm滤膜，在“2.1”色谱条件下测定峰面积。

2.4 线性关系的考察 取S1～S10 10种标样进样体积分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2、4、6、8、10 μL，以峰面积的积分值定量。S1～S10的回归方程及相关系数见表1。

2.5 精密度试验 取含S1 0.36 mg/mL、S2 1.07 mg/mL、S3 1.14 mg/mL、S4 0.69 mg/mL、S5 0.53 mg/mL、S6 0.94 mg/mL、S7 0.05 mg/mL、S8 0.93 mg/mL、S9 0.16 mg/mL、S10 0.15 mg/mL混合对照品溶液，在“2.1”色谱条件下测定色谱峰的峰面积，计算得RSD分别为0.82%、0.90%、0.73%、0.79%、1.1%、0.39%、0.95%、0.66%、0.82%、0.96%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精确称取大籽獐牙菜样品1.000 g，按“2.3”项下方法操作，分别在0、2、4、6、8、16、24 h时进样，测定S1～S10的峰面积，计算它们的RSD分别为1.2%、1.5%、1.8%、1.4%、2.1%、1.2%、1.7%、2.8%、2.3%、1.7%（n=7）。表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 精确称取3份1.000 g大籽獐芽菜样品，按“2.3”项下方法操作，在“2.1”色谱条件下测定S1～S10的含量，计算得RSD分别为1.8%、1.4%、2.2%、3.2%、2.2%、1.3%、2.1%、3.5%、2.6%、3.6%（n=3），表明方法重复性良好。

2.8 回收率试验 精确称取3份大籽獐牙菜样品各1.000 g，精确量取各对照品溶液2.00 mL，按“2.1”项下方法操作，测得S1～S10的平均回收率（n=3）分别为103.1%、100.8%、98.2%、101.5%、99.6%、103.1%、98.9%、104.2%、97.8%、99.3%；RSD分别为3.7%、2.4%、2.8%、1.3%、3.6%、1.8%、4.1%、2.2%、1.9%、2.0%。

2.9 样品测定 取“2.3”项下制备的样品溶液按“2.1”色谱条件进行分析，样品色谱图与标准品色谱图比较指认（图1）后按外标法以峰面积积分值计算，得10种成分的百分含量分别为0.10%、0.02%、0.19%、0.35%、1.36%、0.10%、3.42%、0.17%、2.53%、0.14%（n=3）。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 对照品溶液进样后，利用DAD检测器在200～400 nm扫描其吸收光谱，对照品在254 nm和230nm波长处有较高的吸收峰，选择该波长为检测波长。

3.2 提取方法确定 比较了超声、热回流和索式提取3种不同提取方法；提取时间（30、45、60、75、90 min）对提取率的影响，结果发现，索式提取法略优于热回流提取法和超声，且索式提取75 min即可将有效成分提取完全，故该试验采用索式提取法。

3.3 流动相的选择 实验按“2.1”色谱条件进行时发现不加磷酸的情况下，10种化合物均达到较好的基线分离且不拖尾，故选择甲醇和水作流动相。

3.4 该试验建立的高效液相色谱法具有简便，结果准确、可靠等优点，獐芽菜苦苷、芒果苷的含量较杨慧玲等［10］测定的有差异，这说明不同地域的大籽獐牙菜在成分含量上是有差别的。这对评价药材质量、充分利用药物资源有一定的参考意义。

参考文献：

［1］中国科学院中国植物志编委会.中国植物志（第62卷）［M］.北京：科学出版社，1988：397~399.

［2］张媛媛，管棣，谢青兰，等.大籽獐牙菜化学成分研究［J］.中国药学杂志，2007，42（9）：1299~1301.

［3］Hajimehdipoor H，Sadeghi Z，Elmi S，et al. Protective effects of Swertia longifolia Boiss. and its active compound，swerchirin，on paracetamolinduced hepatotoxicity in mice［J］. J Pharm pharmacol，2006，58（2）：277~280.

［4］Basnet P，Kadota S，Shimizu M，et al. Bellidifolin：a potent hypoglycemic agent in streptozotocin （STZ）induced diabetic rats from Swertia japonica［J］.Planta Med，1994，60（6）：507~511.

［5］Saxena AM，Bajpai MB，Murthy PS，et al. Mechanism of blood sugar lowering by a swerchirincontaining hexane fraction （SWI）of swertia chirayita［J］. Indian J Exp Biol，1993，31（2）：178~181.

［6］Patro BS，Chintalwar GJ，Chattopadhyay S. Antioxidant activities of Swertia decussata xanthones［J］. Nat Prod Res，2005，19（4）：347~354.

［7］曹斐，李冲.龙胆属植物化学成分及药理作用的研究进展［J］.中国新药杂志，2008，17（1）：28~29.

［8］江蔚新，何文顺，赵玺.龙胆多糖的降血脂作用的研究［J］.黑龙江医药，2008，21（4）：33.

［9］江蔚新，赵玺.龙胆多糖的抗凝血作用的研究［J］.黑龙江医药，2008，21（5）：32.

［10］杨慧玲，刘建全.9种“藏茵陈”原植物中的7种有效化学成分研究［J］.中草药，2005（8）：1233~1237.

（收稿日期：2010-12-30）

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