雌激素α受体基因多态性对原发性胆汁性肝硬化TH1TH2类细胞因子表达的影响

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摘要：目的：探究雌激素α受体基因多态性对原发性胆汁性肝硬化Th1 、Th2类细胞因子表达的影响，为临床诊断治疗提供依据。方法：选择本院34名原发性胆汁性肝硬化患者为研究对象，检测每位患者雌激素α受体基因以及th1 th2类细胞因子表达情况，并与正常人结果进行对比分析，为临床诊断治疗提供依据。结果：肝严重损害的患者的IL- 4、 IL- 10含量与肝轻度损害患者的无明显差异，无统计学意义（P>0.05）其含量与r谷氨酰转移酶以及碱性磷酸酶（GGT和ALP）呈正相关；而肝严重损害的患者IL- 2 和TNF- a的含量明显高于肝轻度损害患者，有统计学意义（P

关键词：雌激素α受体基因多态性；原发性胆汁性肝硬化；th1 th2类细胞因子

中图分类号：R575.2 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）9-002-02

原发性胆汁性肝硬化（ PBC） 是一种自身免疫疾病。该病的临床表现主要是长期梗阻性黄疸、因胆汁刺激引起的皮肤瘙痒以及肝大等症状，可伴有高脂血症以及黄色素瘤[1]。肝内小叶间胆管上皮可发生空泡性变性坏死，有胆汁淤积和淋巴细胞浸润，纤维组织进而增生分割小叶，最终导致肝硬化、肝功能衰竭。本次研究通过34名原发性胆汁性肝硬化患者的临床资料，来探究雌激素α受体基因多态性对原发性胆汁性肝硬化Th1 、Th2类细胞因子表达的影响，为临床诊断治疗提供依据。详细报道如下：

1资料与方法

1.1 一般资料

选择本院2009年至2012年在本院治疗原发性胆汁性肝硬化的34名患者为研究对象，男5名，女29名，年龄35-65岁，平均年龄（54±3.2）岁，每位患者均符合原发性胆汁性肝硬化的诊断标准[2]，均未使用过糖皮质激素类、免疫方面类以及熊去氧胆酸治疗，同时每位患者均无肝内占位病变以及其他恶性肿瘤消耗疾病，又根据肝功能异常的程度分类：肝功能严重损害组9名：r谷氨酰转移酶以及碱性磷酸酶高于正常值的5倍；肝功能轻度损坏组11名：r谷氨酰转移酶以及碱性磷酸酶低于正常值的5倍。缓解组14名：经过正规治疗后，肝功能指标均大致达到正常水平，其中，男1名，女13名，年龄为36-65岁，平均年龄为（53±4.7）岁。同时，选择32名健康人为对照组，男4人，女28名，年龄为35-64岁，平均年龄（53±4.2）岁。

1.2 Th1、Th2类细胞因子mRNA表达的检测

取每位研究人员的外周血，采取密度梯度离心法，分离单个核细胞，并置于完全培养液中培养，在培养6小时和24小时后收集细胞，置于37°培养箱里培养，采用异硫氰酸肌法提取细胞RNA，并应用分光计度计比色计量，将其培养液加入逆转录酶、dNTPs、RNasin以及相应的反应缓冲液，进行逆转录，1小时后加热再迅速降温，分离cDNA，放入冰箱内备用。引物扩增应用细胞因子特异引物序列，在10ul的cDNA中加入dNTPs、引物、Taq酶、反应缓冲液，配成聚合酶链式反应（PCR）产物，进行琼脂糖凝胶电泳，采取扫描成像分析，分别测出Th1、Th2类细胞因子的表达情况，认真记录血清白细胞介素- 4（ IL-4） 、白细胞介素- 10 （ IL- 10） 、肿瘤坏死因子α （ TNF- a）以及白细胞介素- 2 （ IL- 2）的含量[3]。

提取到的RNA进行纯度测定并定量，并根据表达Th1 、Th2类细胞因子的引物序列自行设计引物，详细见表1

上述反应采取取5μlPCR产物与2μl Lodding Buffer混合，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V 1.5小时，电泳结束后，凝胶成像仪成像分析，以来了解肝硬化病人RNA中Th1 、Th2类细胞因子的引物序列，为细胞因子的水平与肝功能损伤的关系提供依据。

1.3雌激素α受体基因多态性情况

采用焦磷酸测序技术检测各位点，计算基因型和等位基因型频率，测定的 5 个SNP 位点（ESR1：rs2234693、rs2228480、rs3798577；ESR2：rs1256030、rs1048315）分析正常人与肝硬化病人的雌激素基因有无明显差别。通过实验结果显示：ESR2 rs1256030 各基因型分布无差异，T 等位基因患 PBC 的风险是 C 等位基因的 1.5 倍，差异有统计学意义（P

1.4统计学方法

实验结果应用采用SPSS 1.0统计软件进行数据处理，计量资料采用X±s的形式表示，数据结果分析应用t检验，计数资料之间采用卡方检验。以P

2结果

2.1 细胞因子检测

缓解组血清白细胞介素- 4（ IL-4） 、白细胞介素- 10 （ IL- 10）以及TNF- α的含量与对照组和未治疗组比较，有明显差异，有统计学意义（P0.05）。未治疗组的白细胞介素- 2 （ IL- 2）的含量与对照组和缓解组相比，有明显差异，具有统计学意义（P

2.2 细胞因子的水平与肝功能损伤的关系

肝功能严重损伤未治疗患者的血清中IL- 4、 IL- 10、TNF- a以及IL- 2 的数值分别是：28.75 ±3.52、49.02 ±7.56、181.43±93.56、174.26 ±11.36，而肝功能轻度损坏的患者血清IL- 4、 IL- 10、TNF- a以及IL- 2 的数值分别是：29.14 ±3.56、50.46 ±7.45、

123.14 ±0.426、63.21±24.27。肝严重损害的患者的IL- 4、 IL- 10含量与肝轻度损害患者的无明显差异，无统计学意义（P>0.05）其含量与r谷氨酰转移酶以及碱性磷酸酶（GGT和ALP）呈正相关；而肝严重损害的患者IL- 2 和TNF- a的含量明显高于肝轻度损害患者，有统计学意义（P

2.3雌激素α受体基因多态性与肝功能损伤的关系

雌激素α受体基因中的Pp基因是肝硬化发病的易感基因，携带p基因会导致乙肝患者转化为肝硬化，导致肝功能损坏。P基因导致雌激素受体功能减低以及表达减少，减弱了抗纤维化作用，导致肝硬化产生，影响肝功能。Xbal和PvuII基因的多态性会增加雌激素受体的转录翻译，增加雌激素受体的含量。此外，有研究显示：中国人群中ERα 基因T29C 位点多态性与HBV 持续感染显著相关，进而影响肝功能。

2.4雌激素α受体基因多态性对原发性胆汁性肝硬化th1th2类细胞因子表达的影响

雌激素α受体基因的多态性造成较多的Th1细胞浸润肝组织内，同时分泌TH1细胞因子，本次研究结果外周血中以Th1细胞为主，而Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF等，本次研究结果显示：肝严重损害的患者IL- 2 和TNF- a的含量明显高于肝轻度损害患者，有统计学意义（P

3讨论

原发性胆汁性肝硬化到目前为止还没有明确的致病因素，一般认为该病主要和遗传、环境以及感染有关，女、男性发病率之比接近9：1[4]，疾病高发阶段主要是绝经前后，该阶段雌激素水平变化显著，肝脏对雌激素灭火功能障碍，导致该病发生。雌激素受体的结构、功能以及表达水平均受雌激素受体基因的影响，而雌激素受体基因具有多样性，进而影响雌激素的生物功能[5]。但雌激素的生物活性对原发性肝硬化的th1 th2类细胞因子的表达是否有影响尚不能明确。本次研究针对该问题，通过34名原发性胆汁性肝硬化患者的临床资料，来探究雌激素α受体基因多态性对原发性胆汁性肝硬化Th1 、Th2类细胞因子表达的影响，为临床诊断治疗提供依据[6]。雌激素α受体基因的多态性表达Th1 、Th2类细胞因子的含量不同，导致对肝的影响也不同，造成外周血中Th1细胞含量较多，从而使得Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF等细胞因子含量升高。

结果显示：肝严重损害的患者的IL- 4、 IL- 10含量与肝轻度损害患者的无明显差异，无统计学意义（P>0.05）其含量与GGT和ALP呈正相关；而肝严重损害的患者IL- 2 和TNF- a的含量明显高于肝轻度损害患者，有统计学意义（P

综上所述，雌激素α受体基因的多样性表达Th1 、Th2类细胞因子的含量不同，导致对肝的影响也不同，Th1 类细胞因子介导了对肝脏细胞的破坏作用， 而Th2 型细胞因子则具有一定的保护性作用。雌激素α受体基因中的Pp基因是肝硬化发病的易感基因，同时，雌激素受体基因的多态性会增加肝硬化发生的机率，也会影响PBC患者体内T细胞亚群的偏移及其相关细胞因子的表达。

参考文献：

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[3] Tsuda M， Moritoki Y， Lian ZX， et al. Biochemical and immunologic effects of rituximab in patients with primary biliary cirrhosis and an incomplete response to ursodeoxycholic acid[J]. Hepatology， 2012， 55（2）：512-521.

[4] Rabahi N， Chrétien Y， Gaouar F， et al. Triple therapy with ursodeoxycholic acid， budesonide and mycophenolate mofetil in patients with features of severe primary biliary cirrhosis not responding to ursodeoxycholic acid alone[J]. Gastroenterol Clin Biol， 2010， 34（4-5）：283-287.

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