定心胶囊对房颤大鼠心房肌组织Ca2+-ATP酶及Cx40基因表达影响的实验研究
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摘要：目的：探讨中药定心胶囊对房颠大鼠心房肌组织ca2+－ATP酶及缝隙连接蛋白加(cx40)基因表达的影响，揭示益气养阴活血中药定心胶囊预防和治疗房颤的作用机理。方法：采用氯化钙－乙酰胆碱混合液以鼠尾静脉给药的方式建立房颤的动物模型。筛选具有典型房颤心电图表现的大鼠，随机分为房颤模型组、定心胶囊治疗组、雏拉帕米对照组、加正常对照组，共4组。定心胶囊治疗组、维拉帕米对照组给药治疗，4周后，测定心房肌组织中Ca2+－ATP酶及Cx40基因表达。结果：①治疗组(包括西药、定心胶囊组)与模型组比较能明显升高心房肌组织Ca2+－ATP酶基因表达及降低cx40基因表达(P
关键词：定心胶囊；房颠；Ca2+－ATP醇；缝隙连接蛋白40(Cx40)
中图分类号：R－33
文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2008)0l－0013－03
心房颤动(atrial fibrillation，AF)是心律失常的一种，发病率较高。具有较高致残、致死率，而心房电重构和结构重构是房颤的主要发病机制。因此，通过调节心房重构和结构重构，达到预防和治疗房颤的作用显得至关重要。本实验通过进行房颤大鼠的造模，给予中药定心胶囊，对照药维拉帕米，并且有模型组和空白组4组之间的比较研究，观察房颤大鼠心房肌组织Ca2+－ATP酶及Cx40基因表达的变化，探讨定心胶囊预防和治疗房颤的作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立及分组选择体重250－300g健康Wistar大鼠100只，雄性，清洁级。随机分为正常对照组(10只)及造模组(90只)。采用氯化钙一乙酰胆碱混合液以鼠尾静脉给药的方式建立房颤的动物模型。取1只大鼠，称重，用3％的戊巴比妥钠30mg／(kg・只)进行腹腔注射麻醉，待老鼠昏迷后将其仰卧位固定在木板上，先描记大鼠的正常心电图(记录标准肢导联，见图1)。将其尾部的鳞毛刮干净后注射氯化钙－乙酰胆碱混合液1mL／kg(每毫升中含：Ach 33ug，cacl2 10rag，新鲜配制)，用针形电极刺入四肢，描记大鼠此时的心电图(记录标准肢导联，见图2)。房颤大鼠，分笼饲养，常规喂养饲料与水，连续给药4周后，停药后做心电图(记录标准肢导联，见图3)。心电图有典型房颤改变者为房颤成功模型。
从图1－3，可以明显看到大鼠造模后心电图的改变，P波消失，代之以f波的房颤图形。说明大鼠房颤造模成功。
造模成功大鼠，随机分为AF模型组、定心胶囊治疗组、维拉帕米对照组，加正常对照组，共4组，平均每组8只大鼠。
正常组、模型组每日1次灌服同等容积的生理盐水；益气养阴活血中药定心胶囊治疗组：灌服相当于16.2／(kg・d)生药的定心胶囊，每日2次；西药对照组灌服相当于4.5mg／(kg・d)生药的维拉帕米，每日2次。共用药4周。4周后测定各组大鼠心房肌组织Ca2+－ATP酶及Cx40基因表达情况。
1.2 定心胶囊的制备药物组成：生地、人参、炙甘草、麦冬、丹参等共计8味中药。定心胶囊由辽宁中医药大学附属医院药剂科制备，制成定心胶囊蒸馏水溶液。
1.3 心肌组织Ca2+－ATP酶及Cx40基因表达的测定动物各组用药4周后，用3％戊巴比妥钠麻醉状态下，打开胸腔，取出心脏，在心房肌组织取出4块约50mg心肌组织，于液氮中冷冻后在－70℃条件下保存，采用RT－PCR方法测定心肌组织Ca2+－ATP酶及Cx40基因表达的变化情况。
1.4 数据处理所有实验数据，计量资料均用均数±标准差(x±s)表示，用SPSS统计软件11.0版本，组间比较用方差分析，若方差不齐采用Dunnett检验。
2 实验结果
2.1 各组大鼠心肌组织Ca2+－ATP酶基因表达的变化情况用liT―PCR方法测定Ca2+－ATPmRNA和B－actln表达，并对liT―PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，产生了2条光带，见图4：上面是Ca2+－ATP mRNA表达情况，而下面是B―actin表达情况。再计算Ca2+－ATP mRNA／B―actln的灰密度比值，进行组间比较，如表1所示。
由表1可见：模型组与正常组比较，有显著性差异(P
2.2 各组大鼠心肌组织Cx40基因表达的变化情况用liT－PCR方法测定Cx40基因表达和B―acfin表达，并对liT－PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，产生了2条光带，见图5：上面是Cx40基因表达情况，而下面是p―actln表达情况。再计算Cx40 mRNA／B―actln的灰密度比值，进行组间比较，如表2所示。
由表2可见：模型组与正常组比较，有显著性差异(P
3 讨论
AF是临床常见的心律失常之一。AF时心房肌电重构在AF的发生和发展中起至关重要的作用，直接和间接的－证据表明频率相关的细胞内ca2’超负荷是电重构时心房肌电生理特性改变的始动因素，细胞内的Ca2+的平衡取决于细胞外Ca2+通过L型Ca2+通道进入细胞内和肌浆网对
Ca2+的释放、摄取和储存，其中肌浆网是细胞内钙储存的主要细胞器，它通过释放Ca2+与肌钙蛋白结合而触发心肌收缩；又通过摄取和储存Ca2+，促进心肌舒张。而肌浆网的这些功能是通过Ca2+－ATP、Ca2+－ATP调节蛋白磷酸受纳蛋白、Ca2+释放通道和肌钙蛋白共同作用，来调节心肌细胞内的游离ca2’浓度。Ca2+－ATP又名钙泵，在心肌细胞膜上，钙通道、NA－Ca2+－ATP交换蛋白和Ca2+－ATP三者互相协调，共同维持心肌细胞膜对钙转运的稳定；在肌浆网上.Ca2+－ATP在Ca2+的运输调节中起主要作用，担负2／3的Ca2+运输任务。因此研究Ca2+－ATP mRNA表达的改变是当前AF机制研究领域中的前沿课题。
Cx40是心房电激动传导的主要决定者，它的缺失可使房性心律失常易感性增加。有研究表明AF患者和房颤大鼠模型的心房肌中Cx40 mRNA转录水平上调，其蛋白表达也相应增多。Cx40表达上调可促进心房多发性折返形成。因此心房组织Cx40基因转录上调是促进房颤发生和持续的重要因素。
中医将房颤归属于“心悸”、“怔忡”、“促”、“疾”、“雀啄”、“晕厥”的范畴内。祖国医学认为心房颤动的发生常与心胆气虚、心血不足、心阳衰弱、水饮内停、水气凌心、瘀血阻络等因素有关。其病机主要为本虚标实，尤以本虚为病机关键。
笔者根据临床20余年经验，认为本病是以心气阴两虚、心神失养为主要病机，伴有瘀血内扰心神。故在治疗上应采用“虚者补之”的治疗原则。以滋阴养血、益气活血、复脉定悸为法。用中药定心胶囊治疗本病。定心胶囊是由8味中药组成的，主要成分有生地、炙甘草、人参、黄芪、麦冬、丹参等。经现代药理学的研究定心胶囊有很好的抗心律失常的作用。
经研究证实，生地可增加小鼠心肌营养血流量，减慢心率。可明显对抗大鼠心肌肥厚，抑制心、脑线粒体Ca2+、Mg2+－ATP酶活性，从而保护心脑组织，避免ATP耗竭和缺血损伤。黄芪中的有效成分可显著增加心肌细胞膜钙泵活性，增加细胞内钙离子的转运，从而减少心肌细胞内钙离子的过多积聚。炙甘草有明显的抗心律失常的作用，糖皮质激素样作用，抗氧化、抗过敏和抗衰老作用。人参能够增强心肌收缩力，增加心输出量，具有强心作用；增加冠脉血流量，减慢心率，抗心肌缺血作用，抗缺氧和保护心肌。降低心肌耗氧量，降低血红蛋白对氧的亲和力，向组织释放更多的氧。麦冬及其配伍能提高心肌收缩力和心脏泵血功能，提高小鼠缺血心肌对低氧的耐受力，改善心肌细胞营养、血流量。促进体液免疫，并能缓解钙超载。临床上应用定心汤也有很好的抗房颤作用，有效率达85％。
本次实验证明中药定心胶囊能够上调Ca2+－ATP酶基因转录，达到改善房颤时钙超载，从而延缓心房电重构的发生，阻止AF致AF的作用。同时定心胶囊能明显降低Cx40基因表达水平，可减少心房多发性折返的发生。本实验探讨定心胶囊治疗房颤的作用机理，为益气养阴活血中药对房颤的预防与治疗提供了科学的实验依据。