牛樟芝对高脂血症大鼠主动脉内皮损伤相关基因表达的影响

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[摘要] 目的：研究牛樟芝对高脂血症大鼠主动脉内皮损伤相关基因表达的影响。方法：SD大鼠50只，随机分为5组：正常对照组（N组）、模型组（M组）、牛樟芝低（AC-L）、中（AC-M）、高（AC-H）剂量组（250，500，1 000 mg・kg-1）。用高脂饲料喂养建立大鼠高脂血症模型。10周给药后，分别测定实验大鼠血脂、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，主动脉血凝素样氧化低密度脂蛋白（LOX-1）、P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）、核转录因子-κB（NF-κB） mRNA和蛋白表达；电镜观察主动脉内皮损伤情况。结果：M组血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）含量显著升高（P

[关键词]牛樟芝；SD大鼠；高脂血症；内皮损伤

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种多因素导致的慢性血管性疾病。AS是一个慢性炎症过程，它可导致血管局部单核细胞浸润，促脂质沉积，导致AS早期病变发生。研究认为，血管内皮受损是AS发生的始动环节，其中氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是诱导内皮细胞促炎症细胞因子和促炎症分子表达的主要原因，在内皮细胞损伤发生发展过程中起着关键作用[1]。目前，AS主要是靠药物治疗，牛樟芝（Antrodia cinnamomea，AC）作为一种真菌类中药材，具有抗肿瘤、抗氧化、保肝、抗炎等功效[2]。目前，牛樟芝的效用在肿瘤及癌症方面研究较为普遍，对主动脉内皮损伤研究甚少。本文旨在探讨牛樟芝对高脂饮食大鼠主动脉内皮损伤相关基因表达的影响，从而为进一步明晰牛樟芝预防高脂饮食大鼠内皮损伤的机制提供理论依据。

1材料

1.1药物 液态牛樟芝，上海市肿瘤研究所提供，使用时用0.9%的生理盐水配置成25%的牛樟芝药物溶剂。

1.2试剂与仪器 超氧化物歧化酶和丙二醛测试盒均购自南京建成生物工程研究所；大鼠主动脉LOX-1，P38MAPK，NF-κB酶联免疫试剂盒（上海杰美GENMED医药科技有限公司）；Trizol核酸提取试剂、反转录PCR试剂盒和Real-time PCR试剂盒购自Takara宝生物（大连）有限公司。HITACHI 7170A全自动生化分析仪（日本日立公司）；EL×800全波长酶标仪（美国Bio-Tek公司）；ABI 7500荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）；DYY 8C型电泳设备（北京市六一仪器厂）；电泳凝胶成像分析系统（英国Syngene公司）；SEM（S-4800）扫描电镜（日本日立公司）。

1.3动物 清洁级雄性健康6周龄Sprague-Dawley大鼠50只，体重（220±20） g ，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2006-0009。

2方法

2.1高脂血症大鼠模型的建立及分组给药方案 将50只SD大鼠随机分为5组：正常对照组（N组）、模型组（M组）、牛樟芝低（AC-L）、中（AC-M）、高（AC-H）剂量组，每组10只。N组喂食基础饲料，其余各组给予高脂饲料（78.8%基础饲料、10%蛋黄粉、10%猪油、1%胆固醇、0.2%胆盐）。造模同时，低、中、高剂量组每日以250，500，1 000 mg・kg-1牛樟芝溶剂灌胃，连续给药10周。各组大鼠自由进食和饮水，室温（20±3） ℃，湿度55%。每周日称大鼠体重。

2.2血液和组织样本采集 第10周末，所有大鼠均禁食过夜。用2%戊巴比妥钠（50 mg・kg-1）腹腔注射麻醉。腹主动脉取血，3 000 r・min-1离心10 min，分离出血清分装于Eppendorf管中，-20 ℃冻存待测。小心剥离大鼠腹主动脉，剔除结缔组织，切下1/3迅速置于10%中性多聚甲醛溶液中固定，其余部分迅速置于液氮中冷冻，并于-80 ℃超低温冰箱保存待测。

2.3血脂指标和血清相关指标的测定 采用全自动生化分析仪测定血清中胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量；分光光度比色法测定血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量；TBA法测定血清中丙二醛（MDA）的含量。所有操作均严格参照试剂盒说明书进行。

2.4实时荧光定量PCR法检测主动脉LOX-1，P38MAPK，NF-κB mRNA表达量 Trizol试剂提取主动脉组织总RNA，按照试剂盒说明书操作步骤，获得cDNA产物，并进行PCR反应，β-actin为内参。引物序列检索自NCBI-Nucloetide数据库，采用Primesr5.0软件设计，引物由上海生工生物公司合成。LOX-1，P38MAPK，NF-κB mRNA表达分析采用Real-time PCR SYBGreen荧光染料法测定，配置20 μL体系，具体操作参照试剂盒说明书，每个样品3个重复。循环条件为：预变性 95 ℃ 30 s；PCR反应 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s（共40循环），95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。β-actin上游引物TGTGAAATAGGGGCTGTG，下游引物GGAAGAGGGAAGAACTGG；LOX-1上游引物AAAAAGTCGGGAGAATTGCCTATC，下游引物CCGGGTTTTTGCTTCTGGTCTT；P38MAPK上游引物TTGGTCTGTTGGATGTGTTTAC，下游引物TGGATTATGTCAGCCGAGTG；NF-κB上游引物ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC，下游引物TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT。软件自动生成扩增曲线及融解曲线。2-ΔΔCt值法计算mRNA表达水平。

本实验提示，牛樟芝可以降低高脂饮食大鼠的体重及血清TC，TG，LDL-C含量，同时能够改善内皮损伤症状。牛樟芝对机体主动脉内皮损伤的改善作用可能是通过减少脂质过氧化的中间产物MDA，抑制ox-LDL生成，使LOX-1，P38MAPK，NF-κB表达降低来实现。

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Effect of Antrodia cinnamomea on gene expression related to

aortal endothelial injury in rats with hyperlipidemia

QI Jie1， TAO Yun2， ZHANG Jun3*， FU Jian4

（1. College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China；

2. Olympic College， Nanjing Sport Institute， Nanjing 210000， China；

3. College of Physical Education， Shanghai Normal University， Shanghai 201400， China；

4. College of Physical Education， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

[Abstract] Objective： To investigate the effect of Antrodia cinnamomea on gene expression related to aortal endothelial injury of rats with hyperlipidemia. Method： Fifty SD rats were randomly divided into five groups： the normal control group （NG）， the model group （MG）， the antrodia cinnamomea groups of low， middle and high doses （AC-LG， AC-MG， AC-HG， 250， 500， 1 000 mg・kg-1）. The rats were fed with high-fat diets to establish the hyperlipidemia model. After the drug administration for 10 weeks， their serum lipid， SOD， MDA and ox-LDL， LOX-1， P38MAPK and NF-κB mRNA and protein expression were respectively determined， and the aortal endothelial injury was observed under electron microscope. Result： In the model group， the contents of TC， TG and LDL-C significant increased（P

[Key words] Antrodia cinnamomea； SD rat； hyperlipimia； endothelial injury

doi：10.4268/cjcmm20140925