一株鸽源C型产气荚膜梭菌的分离与鉴定

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摘要：从武汉某地拾到一只死亡的信鸽，剖检观察其病变疑似鸽坏死性肠炎，从其肠内容物中分离到1株细菌，对分离菌株进行形态观察、生化试验、细菌外膜蛋白基因的聚合酶链式反应（PCR）扩增的基因型鉴定及动物试验等，结果鉴定该分离菌株为C型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）。

关键词：鸽产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）；分离；鉴定

中图分类号：S852.61+6.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5808-03

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）又称魏氏梭菌（Clostridium welchii），广泛存在于自然界的土壤、水源、人及动物肠道中，是导致人和多种动物疾病的共患病原菌，严重威胁动物及人类公共卫生安全。Welchii和Nutall于1892年首先从一具腐败的人类尸体中分离得到该菌，并命名为魏氏梭菌，之后世界各地均有各种动物感染该菌发病的报道[1-3]。产气荚膜梭菌通过产生多种外毒素致病，其中α、β、γ、δ是主要的致死毒素，按其所产生的毒素分为5种基因型，其中A型菌产生α毒素，C型菌产生α、β毒素。禽类感染A型或C型产气荚膜梭菌可导致坏死性肠炎，造成严重损失[1-3]，因此对该菌的分离鉴定和基因分型，对禽类坏死性肠炎的防治研究具有重要意义。

2013年3月从武汉某地拾到一只死亡的信鸽，剖检观察其小肠肠管扩张充气、出血严重，粪便呈暗绿色，疑似鸽坏死性肠炎病变，遂取其小肠后段内容物接种于CW琼脂培养基，从中分离到1株细菌，经鉴定为C型产气荚膜梭菌。

1 材料与方法

1.1 材料

病料来源：2013年3月于武汉某地拾到的一只死亡的成年信鸽。

培养基：CW琼脂基础（含卡那霉素）、50%卵黄盐水悬液购自青岛日水生物技术有限公司；含卡那霉素+卵黄的CW琼脂培养基按使用说明书自制。厌气肉肝汤、肉肝胃酶消化汤按《中华人民共和国兽用生物制品规程》[4]自制。

参考菌株：A型产气荚膜梭菌（C57-12株）、C 型产气荚膜梭菌（C59-37株）冻干菌株购自中国兽医药品监察所；大肠杆菌由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医研究室分离保存。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与鉴定

1）细菌的分离培养。无菌取死鸽小肠后段内容物划线接种于CW琼脂培养基，42 ℃厌氧培养48 h。挑取单个疑似菌落纯化培养，取纯培养物接种于厌气肉肝汤，42 ℃厌氧培养24 h，做进一步鉴定。

2）紫牛乳鉴定。取分离菌的厌气肉肝汤培养物接种于紫牛乳微量生化反应管中，42 ℃厌氧培养16 h，观察是否出现爆裂发酵现象。

3）细菌形态观察。挑取分离菌纯培养物涂片、革兰氏染色、镜检。

4）细菌生化试验。取分离菌的厌气肉肝汤培养物分别接种于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、明胶、H2S、硝酸盐、吲哚微量生化反应管，42 ℃厌氧培养24 h。硝酸盐生化反应管加入硝酸盐还原试剂甲、乙各1滴，吲哚生化反应管加入靛基质试剂1滴，明胶反应管培养48 h，放入4 ℃冰箱30 min，观察结果。

1.2.2 细菌的基因型鉴定 采用PCR扩增分离菌株的α-毒素基因、β-毒素基因方法鉴定其基因型，具体参照文献[5，6]的方法进行。

用煮沸法提取分离菌株及参考菌株的模板DNA。

反应体系： 10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs 1.0 μL（10 mmoL/L），上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），Taq DNA聚合酶2.5 U，模板10 μL，用双蒸水补足至50 μL。

反应程序： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸l min，30个循环；72 ℃延伸10 min后于4 ℃保温，结束反应。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，对扩增的基因片段进行测序分析，PCR产物测序由上海生工生物技术有限公司完成。

1.2.3 动物试验 将纯化分离菌株接种于肉肝胃酶消化汤，42 ℃厌氧培养6 h，将菌液腹腔注射3只小鼠，0.3 mL/只，对照组3只小鼠注射等量生理盐水，观察24 h。解剖死鼠，肠内容物涂片、染色、镜检。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与鉴定结果

2.1.1 菌落形态 疑似菌落在含卡那霉素+卵黄的CW琼脂培养基上呈圆形、微隆起、卵黄色、表面褶皱、周围形成白浊环、中等大小的菌落。

2.1.2 紫牛乳鉴定结果 分离菌的紫牛乳鉴定为阳性反应，出现爆裂发酵现象。

2.1.3 细菌形态 在油镜下观察分离菌为革兰氏阳性，菌体两端钝圆，粗杆状，单个、成双或者成短链状存在。

2.1.4 细菌生化试验结果 分离菌对葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、明胶、H2S、硝酸盐还原呈阳性反应，对甘露醇、吲哚呈阴性反应。

综合上述试验结果，分离菌的菌落形态、紫牛乳鉴定、细菌形态、生化试验结果皆符合产气荚膜梭菌特性，鉴定该分离菌为产气荚膜梭菌。

2.2 细菌的基因型鉴定结果

从分离菌中PCR扩增出α-毒素基因片段（长度402 bp）（图1）及β-毒素基因片段（长度196 bp）（图2），与预期扩增的基因片段大小一致。基因片段序列测定结果与GenBank 中已发表的产气荚膜梭菌α-毒素基因、β-毒素基因序列同源性均达到99%。该产气荚膜梭菌的基因型鉴定为C型。

2.3 动物试验结果

接种分离菌液后20 h内，试验组小鼠全部死亡，对照组小鼠全部存活。死鼠肠内容物涂片、染色、镜检，可见与原培养物相同的革兰氏阳性短粗杆菌。

3 小结与讨论

剖检死亡的信鸽可观察到其小肠肠管充气扩张，出血严重，粪便呈暗绿色，呈典型的坏死性肠炎病变。从肠道内容物分离的细菌经鉴定为C型产气荚膜梭菌，动物试验结果证实该信鸽因感染C型产气荚膜梭菌引起坏死性肠炎导致死亡。

信鸽坏死性肠炎是鸽的多发疾病之一，死亡率约为2%。因此，对患坏死性肠炎病情严重的信鸽建议淘汰处理，鸽舍要彻底消毒；病鸽要隔离，可用敏感性抗生素治疗；对健康信鸽减少应激、控制饲料中能量及蛋白质水平、在饲料中加入适量乳酸杆菌及维生素可有效预防该病的发生[7]。

参考文献：

[1] SAIF Y M.禽病学[M].第十一版.苏敬良，高 福，索 勋，译.北京：中国农业出版社，2005.891-893.

[2] 倪学勤，宋振银，曾 东，等.四川地区鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定与基因分型[J].中国共患病学报，2009，25（8）：737-740.

[3] 范世彤.凌源及周边地区动物产气荚膜梭菌病的诊断与防治[J].现代畜牧兽医，2011（4）：37-39.

[4] 中华人民共和国农业部. 中华人民共和国兽用生物制品规程（2000年版）[S].

[5] 段新华，李建军，杨学云，等.多重PCR检测产气荚膜梭菌方法的建立及其临床应用[J].中国动物传染病学报，2010，18（5）：23-26.

[6] YOO H S， LEE S U， PARK K Y，et al.Molecular typing and epidemiological survey of prevalence of Clostridium perfringens types by multiplex PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology，1997，35（1）：228-232.

[7] 吴卫国.信鸽坏死性肠炎的诊治[J].环球赛鸽科技，2004（5）：81.