辛伐他汀纳米粒降低脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的初步研究

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脓毒症是导致危重症的常见原因，它严重威胁着人类的健康。在脓毒症发生起始，内皮细胞极易成为炎症因子的攻击目标，出现内皮细胞骨架改变、细胞间链接破坏，甚至凋亡和坏死，而内皮细胞损伤同时又加剧了炎症反应。如此恶性循环，导致多脏器功能不全发生，内皮细胞功能障碍是脓毒症发展恶化的中心环节，而内皮细胞保护是目前脓毒症研究的重点[1]。

研究发现，他汀类药物具有降脂外“多效性”，包括改善内皮功能、抗炎、抗氧化、免疫调节、降压、抑制血栓形成等[2]。虽然众多研究显示他汀类药物对内皮细胞具有保护作用，但是他汀类药物对脓毒症治疗的疗效仍存在争议。动物实验结果提示，他汀类药物在脓毒症治疗中效率与不良反应使其在临床应用上遇到了极大的困难。因此，目前需要研制一种高效低毒的新型他汀类药物静脉制剂。

纳米粒是药物的载体，目前在靶向抗肿瘤药物和领域已经发挥了重要作用[4]。已经初步显示纳米粒作为一种药物载体能够提高药物的稳定性和靶向性，在提高药物生物利用度、降低药物毒副作用方面具有良好的应用前景。近期国外有学者将纳米粒作为药物载体来研究纳米粒对内皮细胞的靶向性[5]。Lin等[6]研究也发现，内皮细胞靶向性纳米粒作为一种新型药物载体可以增加内皮细胞对药物的吸收、提高药物生物利用度。

本实验旨在建立辛伐他汀纳米粒并探索其是否有降低脂多糖是诱导的内皮细胞损伤作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

辛伐他汀由浙江医药股份有限公司新昌制药厂馈赠，单硬脂酸甘油酯购于上海化学试剂采购供应站，一氧化氮检测试剂盒、内皮型一氧化氮活性和诱导型一氧化氮活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。人脐静脉内皮细胞、ECM培养基、胎牛血清和内皮细胞生长因子购自美国science cell公司。脂多糖购于德国Sigma公司， CCK-8检测试剂购自日本Dojindo公司，鬼笔环肽试剂盒购自美国Cytoskeleton公司。粒度及表面电位分析仪购自英国Malvern公司，高速离心机购自德国Sigma公司，紫外分光光度计购自日本Shimadzu公司。

1.2 辛伐他汀静脉制剂的制备，辛伐他汀纳米粒制备和粒径、包封率和载药量测定

辛伐他汀静脉制剂的制备：取辛伐他汀42 mg，氢氧化钠4 mg，加入无水乙醇10 ml，70 ℃使完全溶解，加0.1 mol/L 盐酸调pH 至7.2，稀释备用。

采用溶剂扩散法制备固体脂质纳米粒[7]，精密称取辛伐他汀12 mg和单硬脂酸甘油酯228 mg，将药物和脂质置于丙酮6 ml和无水乙醇6 ml组成的有机相中，水浴50 ℃使其完全溶解。以质量分数为0.2%的PVA溶液为分散相，置70 ℃水浴中，在400 r /min机械搅拌条件下，将有机相倒入120 ml分散相中，继续搅拌5 min，离心，制得载药辛伐他汀纳米粒。空白纳米粒的制备同上法，将同量单硬脂酸甘油酯替代辛伐他汀。

取制备得到的载药纳米粒分散液1 ml，用蒸馏水稀释20倍，控制纳米粒脂质质量浓度为0.1 mg/ml，用粒度与Zeta电位分析仪测定纳米粒粒径。将离心得到的载药纳米粒沉淀分散于80 ml 质量分数为0.3% 的SDS溶液，漩涡振荡3 min，以溶解未被包封的药物。25 000 r /min离心20 min，上清液用孔径100 nm微孔滤膜过滤，高效液相色谱法测定续滤液中药物质量浓度。分别按（1）式和（2）式，计算药物的包封率和载药量。

1.3 实验分组和处理

将人脐静脉内皮细胞复苏后，用完全ECM培养液（5%胎牛血清，50 ng/ml内皮细胞生长因子）进行培养，第6代进行实验，加药前无血清培养12 h。实验分为4组，健康对照组（control）不进行任何干预，脂多糖组（LPS）在健康对照组基础上加脂多糖5 μg/ml，辛伐他汀静脉组（SIM，iv）在脂多糖组基础上加辛伐他汀静脉制剂1 μmol/L，辛伐他汀纳米粒组（SIM，np）在脂多糖组基础上加辛伐他汀纳米粒1 μmol/L（根据包封率计算的实际有效质量浓度）。

1.4 细胞活性测定

将细胞接种到96空板中，104/孔，80%融合时加药，培养12 h，CCK-8法检测细胞的活性。每孔加入CCK-8液10 μl，37 ℃避光培养4 h，使用酶标仪在450 nm波长下读数，记录细胞活性OD值。

1.5 免疫荧光法检测细胞骨架结构

细胞骨架蛋白F-actin荧光染色按照厂家提供的说明书、参照文献[8]进行操作，具体步骤如下：各组细胞加药培养12 h，用PBS漂洗3次，每次2 min，4%多聚甲醛4 ℃孵育10 min，PBS漂洗3次，每次2 min，再用0.5%曲拉通处理，用FITC标记的鬼笔环肽室温避光孵育1 h，PBS漂洗3次，每次2 min。染色结束后荧光显微镜观察。

1.6 NO含量、eNOS活性和iNOS活性

各组细胞加药培养12 h进行检测，提取细胞培养上清液进行检测，严格根据南京建成生物工程研究所提供的产品说明书进行操作。

1.8 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较用方差分析法，以P

2 结果

2.1 辛伐他汀纳米粒粒径测定、包封率与载药量测定结果

载药纳米粒粒径（350.3±156.9） nm明显高于空白纳米粒粒径（214.3±103.1）nm，P

2.2 辛伐他汀纳米粒对脂多糖诱导HUVECs细胞活性

脂多糖组细胞活性较健康对照组明显下降，（0.524±0.039）vs.（0.943±0.050），P

2.3 辛伐他汀纳米粒对LPS诱导HUVECs细胞骨架改变的影响

如图3所示，健康对照组肌动蛋白呈现清晰的线形纤维，贯穿于细胞质，分布均匀；脂多糖组肌动蛋白纤维结构紊乱，变得粗细不一，分布不均匀；给予不同剂型辛伐他汀处理，细胞骨架结构部分恢复，其中辛伐他汀纳米粒效果较辛伐他汀静脉制剂更加明显。

2.4 培养上清液NO含量影响

脂多糖组（14.647±0.79）μmol/L培养上清液NO含量较健康对照组（3.418±0.453）μmol/L明显上升，P

2.5 培养上清液eNOS和iNOS活性检测结果

脂多糖组培养上清液eNOS活性（0.277±0.015）较健康对照组（0.359±0.013）明显下降（P

3 讨论

脓毒症（sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome， SIRS），其主要致病菌为革兰阴性杆菌。脂多糖也称内毒素，是革兰阴性杆菌的主要致病成份，在脓毒症发生发展中起到重要作用。血管内皮细胞是脓毒症中的主要受损靶细胞，在脓毒症中可被内毒素触发活化，产生大量促炎细胞因子，参与整个炎症反应过程，造成内皮细胞损伤甚至凋亡，并可能进一步导致组织器官功能障碍。他汀类药物具有多效性，除调解血脂外，还具有改善内皮功能，稳定易损斑块、抗炎、抗氧化、免疫调节和抑制血栓形成等作用。王之余等[9]在动物研究中发现，他汀类药物可以调节脓毒症炎症反应过程，达到脏器功能保护的目的。Tleyjeh等[10]研究发现，他汀类的使用可能可以改善脓毒症预后，其作用机制是他汀类药物具有内皮细胞保护作用。纳米粒是一种新型的载药系统，它的粒径通常在10～100 nm范围内，是一种理想的静脉注射的药物载体。药物可以溶解在纳米粒里，尤其适用于脂溶性药物。

采用特殊的纳米技术将辛伐他汀纳米化可能会突破这一技术瓶颈，让他汀类药物在危重患者中能够得到合理使用，改善患者预后。刘泽莹等[11]研究发现，辛伐他汀纳米脂质载体可以促进肠道对辛伐他汀的吸收，同时提高药物生物利用度，显示纳米粒载体具有良好的应用前景。

本课题组采用固体脂质纳米粒技术进行辛伐他汀纳米粒研制，同时对粒径、包封率和载药量进行检测，达到了满意的效果。与辛伐他汀静脉制剂相比，辛伐他汀纳米粒组受损内皮细胞活性提高，辛伐他汀纳米粒能够更大程度减轻脂多糖对内皮细胞骨架结构的影响。进一步发现，脂多糖刺激后，内皮细胞培养上清液一氧化氮含量增加，同时内皮细胞iNOS活性升高。给予不同剂型的辛伐他汀时，脂多糖诱导的内皮细胞培养上清液中一氧化氮含量下降，内皮细胞iNOS活性下降，其中辛伐他汀纳米粒组下降更明显，提示联用辛伐他汀纳米粒出现内皮细胞活性改善的机制可能和一氧化氮合成酶活性相关。

NO 是由一氧化氮合成酶催化L-精氨酸而产生。生理状态下，主要是eNOS活性，产生少量NO，对机体有保护作用，如抑制血小板的聚集、中性粒细胞的黏附、调节微循环血管张力等；但病理情况下，大量iNOS活性，产生过多的NO，NO与超氧阴离子反应形成一种氧化能力极强的自由基过氧化氮，对机体产生损伤[12]。McGown等[13]在脓毒症动物研究中发现他汀类药物提高内皮细胞eNOS表达起到保护效应。Alarez de Sotomayor等[14]研究发现，脂多糖诱导小鼠发生脓毒症时主动脉内皮细胞iNOS表达增加，辛伐他汀预处理可以降低iNOS表达从而起到保护效应。动物实验研究发现，在脓毒症发生时内皮细胞eNOS表达降低、iNOS表达增加，他汀类药物是使用能够逆转这种趋势达到脏器功能保护的效应。本研究结果显示LPS作用于HUVECs可以诱导eNOS活性下调、iNOS活性上调，综合作用产生过量NO，而联用辛伐他汀则使这种效应有所逆转，其中辛伐他汀纳米粒的作用更强。

参考文献

[1]Shapiro NI， Aird WC.Sepsis and the broken endothelium[J].Crit Care，2011，15（2）：135.

[2] 徐敏，邢金燕，孙运波. 他汀类药物治疗脓毒症机理研究进展[J].中华急诊医学杂志，2011，20（12）：1342-1343.

[3] Gill S， Brown AJ.Exploiting a physiological regulator to improve the efficacy and safety of statins[J].Cardio Drugs & Therapy， 2011， 25（2）：183-185.

[4] von Maltzahn G，Park JH，Lin KY，et al.Nanoparticles that communicate in vivo to amplify tumor targeting[J].Nature Materials， 2011，10（7）：545-552.

[5] Panyam J， Labhasetwar V.Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue [J].Adv Drug Deliv Rev，2003，55（3）：329-347.

[6]Lin A，Sabnis A，Kona S，et al. Shear-regulated uptake of nanoparticles by endothelial cells and development of endothelial-targeting nanoparticles[J]. J Biomed Mater Res A， 2010，93（3）： 833-842.

[7] HU FQ，JIANG SP，DU YZ，et al. Preparation and characterization of stearic acid nanostructured lipid carriers by solvent diffusion method in an aqueous system [J]. Colloids Surf B，2005，45（3/4）：167-173.

[8] Auinger S， Small JV.Correlated light and electron microscopy of the cytoskeleton [J]. Methods Cell Biol，2008，88（2）：257-272.

[9]王之余，于健，顾金萍，等. 阿托伐他汀对脓毒症大鼠肿瘤坏死因子α的影响[J].中华急诊医学杂志，2011，20（10）：1047-1051.

[10]Tleyjeh IM， Kashour T， Hakim FA， et al. Statins for the prevention and treatment of infections： a systematic review and meta-analysis [J]. Arch Intern Med ，2009，169 （18）：1658-1667.

[11]刘泽莹，沈淑慧，蒋世军，等，辛伐他汀纳米脂质载体的制备及大鼠体内药动学[J]. 中国医药工业杂志，2013，44（1）：46-49

[12] Fortin CF， McDonald PP， Fülp T， et al. Sepsis， leukocytes， and nitric oxide （NO）： an intricate affair [J].Shock，2010，33（4）：344-352.

[13] McGown CC， Brown NJ， Hellewell PG， et al.Beneficial microvascular and anti-inflammatory effects of pravastatin during sepsis involve nitric oxide synthase III[J]. Br J Anaesth，2010，104（2）：183-190.

[14] Alvarez de Sotomayor M， Vega S， Mingorance C， et al. Effects of HMG-CoA reductase inhibition by simvastatin on vascular dysfunction induced by lipopolysaccharide in rats [J]. Pharmacology，2008， 82（2）： 89-96.

（收稿日期：2013-04-04）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.10.012

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金（81101445）；浙江省医药卫生科技计划基金（2013KYA059）

作者单位：310009 杭州，浙江大学医学院附属第一医院ICU（汪日红、郑霞、方强），药剂科（姜赛平）

通信作者：方强，Email： ；郑霞，Email：

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