失活/存活模型在大肠杆菌O157∶H7风险分析中的应用

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264000；3. 云南农业大学食品科技学院，云南昆明 650201)

摘要：目的研究出口分割鸡肉中大肠杆菌O157∶H7的控制措施。方法建立了出口分割鸡肉中大肠杆菌O157:H7在速冻过程中的失活模型和在－18℃下的存活模型，通过风险分析提出控制措施。结果利用所建模型定量描述了出口分割鸡肉从成品到消费过程中大肠杆菌o157∶h7带菌量的变化，得出摄入1份鸡肉感染大肠杆菌O157:H7病的风险。结论本研究提出的控制措施可提高出口分割鸡肉的安全性。

关键词：大肠杆菌O157∶H7；预测模型；风险分析；控制措施

中图分类号：Q 939.121文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)05-0042-05

Application of Deactivation/ Survival Models in Risk Analysis of Escherichia coli O157:H7

ZHU Ying-lian1, LI Yuan-zhao2, GUO Li-ping1, ZHANG Pei-zheng3

（1.College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2.Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China; 3.College of Food Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

Abstract：Objective Study the control measures of Escherichia coli O157∶H7 in the exported divided chicken. Methods The deactivation model in deepfreeze and survival model at -18℃ of Escherichia coli O157∶H7 in the exported divided chicken were established to obtain the control measures by risk analysis. ResultsThe quantitative change of Escherichia coli O157∶H7 from product to consumption was quantitatively described by using the above models and the risk of eating one portion of chicken that caused disease of Escherichia coli O157∶H7 was evaluated. Conclusion The control measures mentioned in this study can increase the safety of the exported divided chicken.

Key words：Escherichia coli O157∶H7; predictive model; risk analysis; control measure

1982年美国Riley等首次报道了肠出血性大肠杆菌O157:H7 （Escherichia coli O157∶H7）导致出血性肠炎暴发流行，此后受感染的国家和地区不断扩大。1996年日本[1]发生大肠杆菌O157∶H7暴发流行，引起全世界的关注。2002年初，我国14个省、自治区、直辖市分离出病原菌，有8个省、自治区、直辖市发生由此菌引起的出血性肠炎，表明此菌已对我国人口健康构成了威胁。我国是肉鸡生产大国，大肠杆菌O157∶H7污染会影响肉鸡产品出口。大肠杆菌 O157∶H7以产Vero毒素为主要特征，感染后可引起出血性肠炎，严重者并发溶血性尿毒综合征和血栓性血小板减少性紫癜等。文献报道，感染剂量低达10个菌体 [2]。本实验建立了出口分割鸡肉中大肠杆菌O157∶H7在速冻过程中的失活模型和在－18 ℃下的存活模型，并利用模型定量描述了从出口分割鸡肉加工成品到消费过程大肠杆菌O157∶H7带菌量的变化。将定量数据代入剂量-反应公式，得出摄入1份污染鸡肉感染大肠杆菌O157:H7病的风险，并以模型和风险分析为依据提出了控制出口分割鸡肉污染的措施。国外已开展了大肠杆菌O157:H7预测模型[3,4]及风险分析的研究[5,6]，国内尚未见有关报道。

1实验材料

1.1菌种

大肠杆菌O157:H7菌种（菌种号：EDL933），由中国医学细菌保藏管理中心提供。

1.2培养基和试剂

营养琼脂，平板计数琼脂，氯化钠，氢氧化钾，0.1 mol/L盐酸（北京陆桥技术有限责任公司）。

1.3设备和材料

智能型全温振荡器（5~50）℃±0.5 ℃（哈尔滨东联电子技术有限公司）；机动门真空灭菌器（山东新华医疗器械公司）；浊度计（法国生物梅里埃公司）；1 mL加样器（德国Eppendorf公司）；排击式均质器（法国Interscience公司）；速冻机（浙江三雄机械制造有限公司）等。

2实验方法

2.1低温生长实验

无菌操作，取大肠杆菌O157:H7营养琼脂斜面37 ℃18～24 h的培养物，刮取菌苔，在无菌生理盐水中制成菌悬液。配制100 mL营养肉汤，121 ℃灭菌15 min。将菌悬液适当稀释接入灭菌营养肉汤，制成100 mL接种液，置入鸡肉，搅拌并浸泡30 s，取出在滤网上控水1 min，电子天平上称取10 g/份，分装入无菌均质袋密封。取1份加90 g无菌生理盐水，均质，取均质液1 mL，平板计数法测初始菌数。分装后的样品置入5，8，10 ℃培养箱各10份培养，每隔一定时间取出培养物测菌数。

2.2失活/存活实验

2.2.1速冻失活实验按2.1方法将接种后的鸡肉分装入无菌均质袋，密封。在鸡肉中接种不同浓度的大肠杆菌O157:H7。鸡肉通过－35 ℃速冻机，使中心温度在30 min内达到－18 ℃。速冻后立即测每袋鸡肉接种浓度的菌数，观察速冻前后菌数的变化。

2.2.2速冻后－18 ℃存活实验将速冻后样品置于－18℃低温冰箱，每隔一段时间，取1份加90 g无菌生理盐水，均质后取均质液1 mL，用稀释倒平板法测菌数。

2.3建立失活/存活模型

绘制大肠杆菌O157:H7失活/存活曲线，用CurveExpert分析。通过拟合大肠杆菌O157:H7的失活/存活曲线，建立鸡肉速冻过程大肠杆菌O157:H7失活模型及速冻后－18℃鸡肉中大肠杆菌O157:H7存活模型。

3结果与分析

3.1低温生长情况

研究表明，出口分割鸡肉中大肠杆菌O157:H7在5 ℃培养15 d甚至更长时间，8 ℃培养3 d，10 ℃培养1 d菌数基本不变，8 ℃培养超过3 d，10 ℃培养超过1 d菌数缓慢增长。

3.2速冻过程大肠杆菌O157:H7失活情况

N0为初始菌数，Ns为速冻后菌数。以lnNs为y轴，lnN0为x轴，得线性回归曲线，用 Linear方程拟合大肠杆菌O157:H7在速冻过程中的失活曲线，见图1。

回归方程式：lnNs＝－0.111 820 45+1.005 138 3 lnN0，标准差s = 0.026 425 82，相关系数r＝0.999 921 93，拟合较好。

图1Linear方程拟合的大肠杆菌O157:H7速冻失活曲线

3.3－18℃大肠杆菌O157:H7存活情况

Nt为t时的菌数，t为时间（d），－18 ℃鸡肉中大肠杆菌O157:H7的存活菌数与时间的关系见图2；以ln(N0/Nt)为因变量，进行线性回归，Linear方程拟合的大肠杆菌O157:H7在－18 ℃鸡肉中的存活曲线见图3。

拟合的回归方程式：ln(N0/Nt)=－0.060 340 863+0.010 692 795×t，标准差s＝0.025 453 18，相关系数r＝0.998 737 59，曲线拟合情况较好。

3.4失活/存活模型在大肠杆菌O157:H7风险分析中的应用

从生产到消费的过程中，大肠杆菌O157∶H7的生长受鸡肉性质、环境温度、贮藏时间及生长繁殖特性等的影响。在加工过程中，各车间的温度一般是可控制的。产品进入销售过程，温度就难以控制，温度波动会导致细菌生长繁殖。本研究定量描述了从成品到消费过程出口分割鸡肉中大肠杆菌O157∶H7带菌量的变化，将定量数据代入剂量-反应公式，得出摄入1份鸡肉感染大肠杆菌O157∶H7病的风险。本试验研究了成品、速冻、仓库存放、零售、购买、冰箱存放、烹制、消费等环节大肠杆菌O157:H7带菌量的变化，结果见表1。

根据检测数据，确定包装后成品带菌率为0.1％ ～1.5％。假设5种情况，即带菌率分别为0.1％，0.2％，0.4％，0.8％，1.5％，带菌量分别为0.01，0.1，1.0，10，100 cfu /g。经－35 ℃速冻、－18 ℃贮存，大肠杆菌O157:H7部分失活，存活菌数分别用相应模型计算。消费者购买及冰箱存放过程中，由2.2可知，大肠杆菌O157:H7的数量基本不发生变化。在产品的烹制阶段，假定未充分煮熟的概率为P1（0.05～0.15），未熟部分比例P2（0.1～0.2），则附着在未熟部分的大肠杆菌O157:H7的数量用Np＝Ni×P1×P2公式计算，结果见表1。

已知鸡肉中大肠杆菌O157:H7在70，67.5，65 ，62.5 ，60 ℃的D值分别为0.176，0.286，0.36，0.82，1.63。假定大肠杆菌O157:H7在上述温度下的持续时间分别为1.5，1.0，1.0，0.5，0.5 min，根据D值的定义，计算出烹制后每人每餐摄入大肠杆菌O157:H7的剂量（表1）。再将所得数据分别代入以下剂量-反应模型： P=1-e-rN，r为病原菌特定常数， N为摄入剂量（cfu）。易感人群：r=9.3×10-3 ，一般人群：r=5.1×10-3 。得出5种情况下的发病概率，易感人群为：1.739 098 6E-7，7.048 440 41E-06，2.196 882 2E-04，0.021 739 8，0.309 742，一般人群为：9.536 993 13E-8，3.865 279 930E-06，1.204 801 61E-04，1.198 098 E-2，0.183 951 74。

再分别乘以每种情况下假定带菌率，所得的发病率易感人群为：1.739 098 6E-10，1.409 688 08E-8，8.787 528 8 E-07，1.739 184 E-04，4.646 13E-03。一般人群为：9.536 993 13E-11，7.730 559 860E-09，4.819 206 425E-07，9.584 785E-05，2.759 276E-03。

假定一个20 000 000人口的国家，有75％的人平均每人每年食用鸡肉26次，易感人群发病率为：0.067 824 8454，5.497 78，342.713 6，67 828.17，1 811 99 0.700人次/年，一般人群为：0.037 194 3，3.014 918 345，187.949 05，37 380.661 50， 1 076 117.640人次/年。

4讨论

（1）鸡肉中接种不同浓度的大肠杆菌O157:H7，通过速冻测其前后菌数变化，发现速冻后菌数略有降低，但变化不大。表明速冻过程只能使部分菌体失活，多数菌仍能存活。实际生产中速冻对大肠杆菌O157:H7数量的影响很小，原因是此菌耐冷性极强。因此，鸡肉制品应在速冻前控制菌的数量，在速冻、包装及贮存、销售时主要是防止二次污染。

（2）在－18 ℃存活实验中，大肠杆菌O157:H7被完全抑制，菌数呈缓慢下降趋势，但在很长时间内仍有存活者。接种菌浓度在104数量级，经3个月后，菌数下降小于1个数量级，菌的对数值缓慢下降。因此，－18℃冷藏起不到杀菌作用，应在低温冷藏前控制菌的数量。

（3）大肠杆菌O157∶H7感染剂量极低，致病性很强，一旦受感染危险性很大。风险分析表明，无论是易感人群还是一般人群，如鸡肉成品带菌率低于0.1%，感染概率很低；如成品带菌率高于1.5%，感染概率则很高。因此，要减少因食用鸡肉感染大肠杆菌O157∶H7病的风险，必须在速冻前将成品带菌率控制在0.1%以下。

（4）大肠杆菌O157∶H7的污染来源主要是带菌原料鸡、破损的内脏、屠宰加工及环境中的交叉污染。为保证出口分割鸡肉的安全，应尽可能的杜绝污染来源，降低原料鸡的带菌率，饲用无大肠杆菌O157∶H7污染的饲料，严格宰前检疫和宰后检验，严格控制宰杀及取脏环节的操作。搞好加工环境及加工操作的卫生，防止交叉污染，严格执行GMP规范。在加工过程中，严格控制各车间的温度，防止温度升高导致此菌的生长繁殖。

（5）为防止出口分割鸡肉在养殖和加工中被大肠杆菌O157∶H7污染，避免环境温度波动，可通过建立大肠杆菌O157∶H7温度生长预测模型，不经培养直接得到此菌在不同温度、不同时间的生长、繁殖或死亡的信息，并预测产品的菌量指标及在不同贮存环境下的货架期和产品安全性，有针对性的采取防控措施。

5结论

严格控制从养殖到销售各环节的温度，防止发生大幅度波动，可有效抑制大肠杆菌O157∶H7的生长繁殖。因此，加工、销售环节环境温度最高不能超过10 ℃，并要尽可能地缩短鸡肉的贮存、运输时间，严格防止二次污染，以保证我国出口分割鸡肉的安全性。

参考文献

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