羊传染性脓疱病毒VEGF基因的克隆及分析
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摘要：根据发表的羊传染性脓疱病毒参考株S-1的序列设计一对引物，以羊传染性脓疱病毒感染的原代犊牛细胞提取总DNA为模板，PCR扩增得到426bp片段，PCR产物克隆至pMD18-T载体，鉴定后测序。序列分析结果表明，毒株Orf-ys的vegf基因与参考毒株的相关基因核苷酸同源性从4.4%到97.8%不等。基因进化树比较显示，与美国的Orf-11株和日本的Matsumoto株、R-1株及S-1株的进化关系最近。
中图分类号： S85 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-02-0176-2
羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma) 俗称羊口疮(Orf)，是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus)引起的一种接触性、嗜上皮性人畜共患传染病。近年来该病屡有爆发，出现再流行的趋势，世界各地均有该病的报道[1-3]。郑长有等报道一例（2005年）山西省保德县养殖场饲养的山羊突然发生羊传染性脓疱，发病率为40%，死亡率为30%[4]。羊传染性脓疱病毒的开放阅读框ORF132基因即VEGF基因，它表达血管内皮生长因子样蛋白质，是Orf病毒的毒力构成因子，是刺激宿主免疫应答的主要抗原之一[5]。因此，本实验对分离株Orf-ys的VEGF基因进行克隆并测序、进行序列分析以及构建系统进化树，目的在为研究本病的流行规律和研制新型疫苗做好研究基础。
1 材料与方法
1.1 试剂
常规分子生物学试剂、DNA聚合酶、E.coli DH5α及pMD18-T载体均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自Vitagene公司。
1.2 病毒培养
Orf-ys株为本实验室分离鉴定所有，按1mL量接种传代犊牛细胞(100mL培养瓶)，培养4-5d，待70-80%的细胞出现CPE时收获细胞及上清，冻融3次。
1.3 VEGF基因的克隆
1.3.1 PCR引物设计 参照发表的Orf基因序列，利用Primer 5.0 软件自行设计一对引物，两端分别添加EcoR I 和Sal I 酶切位点，上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
Orf V-F: 5’-GAATTC ATGAGGTTGCTCGTCTGCAT-3’
Orf V-R: 5’-GTCGACCTAATAAGCCCTTCGGCGCC-3’
1.3.2 PCR扩增模板基因组提取 将出现病变的细胞培养瓶中的单层细胞反复冻融3次，加入SDS和蛋白酶K至终浓度分别为5mL/L和0.2mg/L进行消化，以Tris平衡酚溶液、氯仿-异戊醇溶液反复抽提细胞基因组DNA两次，溶于TE缓冲液中。PCR反应的总体系为50μL：10×PCR Buffer5μL；dNTPs(各2.5mmol/μL)4.0μL；ExTaq DNA聚合酶(5u/μL)0.5μL；Orf V-F(20 pmol/μL)1μL；Orf V-R (20pmol/μL)1μL；模板DNA 2.0μL；灭菌去离子水24.5μL。PCR反应条件：95℃4min，94℃40s，52.6℃40s，72℃30s，30个循环，72℃10min。扩增产物于0.8%琼脂糖凝胶中电泳。
1.3.3 目的基因的克隆和测序 用DNA凝胶回收试剂盒对回收的PCR产物进行纯化，将纯化的目的产物与pMD18-T载体连接，构建的重组质粒命名为PMD18-T-VEGF，转化制备DH5α感受态细胞，将PMD18-T-VEGF转化入感受态细胞中，培养在含有氨苄青霉素的琼脂平板上，PCR方法鉴定鉴定单菌落。将鉴定正确的菌落提取质粒送测序公司进行序列测定。
1.4 序列比较分析及进化树绘制
利用DNAStar软件将测定结果与国外部分参考毒株进行序列同源性分析并构建系统进化树。
2 结果与讨论
2.1 病毒培养
培养的细胞单层接种病毒36h后，有小部分的细胞悬浮，72h后局部有贴壁细胞变圆。随着时间的延长，病变部位不断扩大，最后大片细胞呈网状结构脱落，待6d时细胞病变达到80%时收毒。对照细胞组生长正常。病毒培养产生的细胞病变特征基本与詹述宣等描述的一致[6]。但该病毒产生CPE的时间与相关报道差异较大，病变所需时间较长，而很多报道仅几个小时。
2.2 病毒基因的克隆及鉴定
将病毒PCR产物克隆于pMD18-T载体中，用琼脂糖凝胶电泳和PCR鉴定，显示片段大小与预期一致。将鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序，证实插入的DN段大小为426bp，与预期设计完全一致(图1)。
Fig.1 Identification of the PMD18-T-VEGF by PCR
1Marker DL2000 2negative control
3 PCR prducts of VEGF
4 Recombinant plasmid PMD18-T-VEGF
2.3 序列比较及分析
利用DNAStar软件将Orf-ys株VEGF基因测序结果与Genbank中登录的部分Orf病毒毒株进行序列比较。结果显示，VEGF基因与参考毒株的序列同源性从4.4%到97.8%不等，差异比较大，主要是与印度毒株Mukteswar-09的差异最大，同源性只有同源性4.4%，其中原因有待于进一步研究。Orf-ys株而与其他几株比较同源性较高，均达到70%以上。其中与美国的Orf-11株和日本的Matsumoto株、R-1株及S-1株的进化关系最近均达到95%以上。VEGF基因为Orf 病毒的毒力基因之一，其基因变异值得关注研究。
2.4 遗传进化关系
将所测定的Orf-ys分离株的VEGF基因与国内外发表的毒株相应片段作序列分析，应用软件绘制系统进化树(图2)，VEGF基因进化树结果显示，与美国Orf-11株亲缘关系较近。
Fig.2 Phylogenetic trees based on the VEGF gene
本研究利用犊牛细胞培养Orf病毒，成功克隆VEGF基因，并根据其核酸序列分析了该分离株与其他参考病毒株的差异，为本病流行规律的探索和新型疫苗研制奠定了基础。
参考文献
[1] Key S J，Catania J，Mustafa S F，et al.Unusual presentation of human giant orf(ecthyma contagiosum)[J].J Craniofac Surg,2007, 18(5):1076-1078.
[2] Hosamani M，Yadav S,Kallesh D J,et al.Isolation and characterization of an Indian orf virus from goats[J].Zoonoses Public Health,2007,54(5):204-208.
[3] Chan K W，Lin J W，Lee S H，et al.Identification and phylogenetic analysis of orf virus from goats in Taiwan[J].Virus Genes,2007,35(3):705-712.
[4] 郑长有,郑长春,龚子武.一例小尾寒羊传染性脓疱病的诊治[J].养殖技术顾问,2007,(9):51.
[5] Alessandra Scagliarini , Fabiana Dal Pozzo ,
Laura Gallina, et al. In vitro activity of VEGF-E produced by orf virus strains isolated from classical and severe persistent contagious ecthyma[J]Vet Microbiol,2005,114(2006):142-147.
[6] 詹述宣，薛双虎，薛掌林,等.犊牛细胞培养羊传染性脓疱皮炎病毒的研究[J].兽医科技杂志,1983,(7):5-7.
作者简介：张学禹（1984-），男，吉林长春人，硕士研究生，研究方向：畜禽病原微生物研究。
通讯作者：钱爱东，吉林农业大学教授。