降钙素基因相关肽介导骨折愈合的实验研究
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[摘要] 目的 研究降钙素基因相关肽（CGRP）对骨折愈合的作用。 方法 36只SD大鼠随机分为A、B、C 3组，每组12只，制备右下肢股骨干骨折模型。A组注入重组的pcDNA3.1-CGRP质粒溶液；B、C分别注入单纯pcDNA3.1质粒溶液和磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照。分别于2、4周后观察骨折愈合情况和CGRP的表达水平。 结果 术后2周时，A组动物骨折端有骨性骨痂形成，B、C组未见形成；A组CGRP蛋白相对量（0.438±0.026），明显高于B组（0.186±0.009）、C组（0.173±0.011），差异有统计学意义（P < 0.05）。术后4周时，A组动物骨折端完全愈合，B、C组仅形成骨性骨痂；A组CGRP蛋白相对量（0.367±0.033），明显高于B组（0.107±0.043）、C组（0.152±0.033），差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 降钙素基因相关肽能够促进骨折的愈合。
[关键词] 骨折；降钙素基因相关肽；基因重组；质粒转染；愈合
[中图分类号] R68 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0164-03
骨折是骨科临床中最为常见的疾病，特别是随着交通事故的频发，骨折患者的数量也呈逐年上升的趋势。目前，骨折的治疗方式主要包括切开复位和闭合复位，但无论哪种方式都存在延迟愈合甚至不愈合的可能，给患者的身心造成极大的痛苦。针对这一问题，国内外学者先后采用了机械固定、骨移植、电刺激、骨诱导等多种方法进行治疗[1-3]，虽然取得了一定的进展，但均不能完全解决骨折不愈合的难题。本研究采用与骨代谢密切相关的降钙素基因相关肽（CGRP）转染入骨折断端，观察其对骨折动物模型的愈合作用，在基因水平为促进骨折的愈合提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
36只SD大鼠，平均体重（200±10）g ，由中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032；pcDNA3.1-CGRP质粒（Invitrogen，美国），E.coli. DH5α（哈尔滨医科大学附属第四医院实验室提供），CGRP引物、dNTP（TAKARA，日本），Hind Ⅲ、BamHⅠ（博士德公司，中国武汉），兔抗大鼠CGRP单克隆抗体、生物素二抗、AP二抗（博士德公司，中国武汉）。
1.2 实验方法
1.2.1 pcDNA3.1-CGRP质粒的转化 应用CaCl2溶液将E.coli. DH5α制备成感受态E.coli. DH5α，加入到50 mL离心管中，向离心管中加入5 μL pcDNA3.1-CGRP质粒，冰浴30 min，42℃热休克90 s，再冰浴2 min。向管中加入SOC培养基800 μL，37℃培养45 min，使恢复大肠杆菌的正常生长状态并且表达抗生素的抗性基因。将菌液涂于含有50 μg/mL氨苄青霉素的SOB平板上进行抗性筛选。
1.2.2 CGRP的PCR及酶切鉴定 待菌落长出后，挑选饱满菌落对CGRP行PCR检测，向体系内加入5×PCR Buffer 4 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各1 μL（表1），Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O定容至20 μL。95℃变性60 s，60℃复性60 s，72℃延伸60 s，30个循环后，72℃延伸5 min，4℃保温。对产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。对于PCR鉴定阳性菌落，扩增提取质粒后，加入10×K Buffer 2 μL，Hind Ⅲ 1 μL，BamHⅠ1 μL，质粒-PCR混合物15 μL，ddH2O定容至20 μL，37℃反应8 h后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。
表1 聚合酶链反应引物列表
注：CGRP：降钙素基因相关肽；GAPDH：内参基因；“-”代表无内切酶
1.2.3 pcDNA3.1-CGRP质粒溶液的配制 选取pcDNA3.1-CGRP鉴定为阳性克隆菌株，扩增后应用QIAGEN Plasmid Midi Kit提取质粒，0.22 μm滤器除菌干燥后加入到含20%蔗糖的PBS溶液中，配制成浓度为1.0 g/L的pcDNA3.1-CGRP质粒溶液，同时配制1.0 g/L的单纯pcDNA3.1质粒溶液，-20℃保存待用。
1.2.4 动物的分组及模型制备 36只SD大鼠随机分为A、B、C 3组，每组12只，3.5%水合氯醛（1 mL/100g）腹腔麻醉，右下肢常规备皮消毒后，切开皮肤及皮下组织，分离暴露股骨，于股骨中点处用摆锯将股骨横行锯断，克氏针固定后逐层缝合。术后24、48 h两个时间点，A组每只动物于骨折处经皮注入pcDNA3.1-CGRP质粒溶液1 mL，B组注入单纯pcDNA3.1质粒溶液1 mL，C组注入PBS溶液1 mL作为阴性对照。于术后2、4周检测骨折愈合情况。
1.2.5 骨折端的X线检查 于术后观察大鼠一般状态及切口情况，对每组动物均进行X线检查，记录骨折复位情况。分别在2、4周时每组分别选取6只大鼠，在X线下观察骨折断端骨痂的形成情况，并与术后进行比较。
1.2.6 CGRP的免疫组化检测 术后2、4周两个时间点每组各随机选取6只大鼠，乙醚麻醉后处死，取骨折端周围骨组织、骨膜组织和骨骼肌，4%多聚甲醛固定后，骨组织EDTA脱钙处理。切片脱蜡后，3 % H2O2浸泡20 min，加入兔抗大鼠CGRP单克隆抗体（1∶200），室温过夜；PBS冲洗，加入生物素二抗（1∶400），37 ℃孵育30 min；PBS冲洗后加入新配制DAB显色。以PBS代替一抗作为阴性对照，每个标本随机选取6张切片，每张切片随机选取6个高倍视野，应用Image-ProPlus图像分析系统测定平均光密度值，并进行统计学分析。
1.2.7 CGRP的Western blot检测 术后2、4周两个时间点，取处死动物的骨膜组织，加入1 mL细胞裂解液，冰上裂解5 min，经超声细胞粉碎仪粉碎后，4℃低温离心10 min（12 000 r/min），取上清加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液电泳。转膜封闭后，加入兔抗大鼠CGRP单克隆抗体（1∶200），室温过夜；TBST冲洗后加入AP标记的二抗（1∶400），孵育1 h，加AP显色液显色。应用Image-ProPlus图像分析系统测定平均光密度，并进行统计学分析。
1.3 统计学方法
应用SPSS 18.0采用统计学软件进行数据分析，PCR、免疫组化及Western blot的检测结果的相对值以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CGRP的PCR及酶切鉴定
质粒转化后，对饱满菌落PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，有4个克隆菌落在成像仪下可见大小相同的特异性片段，与CGRP的cDNA相吻合。对这4个克隆菌落提取质粒酶切后进行电泳，在凝胶成像仪下可见两条特异性条带，其大小分别与pcDNA3.1和CGRP相一致。
2.2 骨折端的X线检查
实验动物术后一般状态良好，切口无感染，右下肢跛行。术后行X线检测，各组动物骨折端对位对线良好，横行骨折线清晰可见。术后2周时，A组动物可见明显的骨性骨痂形成，B、C组骨性骨痂不明显；术后4周时，A组动物骨折端均已骨性愈合，骨折线消失，2只动物出现骨髓腔再通，其余四肢尚未再通，B、C组动物可见骨性骨痂形成，骨折线模糊，其中B组1只动物未见骨痂形成。
2.3 CGRP的免疫组化检测
术后2周时，A、B、C三组切片均可见CGRP的阳性表达，骨、骨膜、骨骼肌的CGRP平均光密度值见表2。A组的CGRP表达水平均高于B、C组，差异有统计学意义（P < 0.05），说明CGRP基因在A组不同组织均有转染；A组CGRP的表达水平在骨膜组织明显高于骨组织和骨骼肌组织，说明CGRP基因在骨膜组织的转染率较高。术后4周时，A组CGRP表达较2周时明显下降（P < 0.05，图1）；B、C组未见CGRP表达。
表2 术后2周时CGRP的免疫组化光密度值（x±s）
注：与A组比较，*P < 0.05
与术后2周比较，*P < 0.05
图1 术后2、4周时A组CGRP平均光密度值比较
2.4 CGRP的Western blot检测
Western blot检测采用管家基因GAPDH作为内参，电泳条带亮度一致，三组蛋白形成的CGRP条带密度不同。根据公式：CGRP相对量=CGRPF产物电泳条带密度/GAPDH×100%，计算各组蛋白量，结果见表3。A组动物CGRP的表达量在两个时间点较B、C组均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），B、C组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。
表3 三组CGRP蛋白表达相对量比较（x±s）
注：与A组比较，*P < 0.05
3 讨论
骨折是骨科最为常见的疾病之一[4]，多数由意外所致，给患者身心造成极大痛苦，如何提高骨折愈合时间，恢复患者的正常生活是创伤骨科临床中面临的重要问题之一[5]。对于骨折延迟愈合甚至不愈合，许多学者采用不同方法均取得一定疗效[6-8]，但并未能完全解决这一难题。骨折的愈合是较为复杂的病理生理过程，在细胞水平涉及成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞等多种细胞的参与[9]；在分子水平又涉及多种细胞因子、炎症因子的相互作用[10]。其中，由于CGRP参与骨代谢的过程，在骨折的愈合过程中显得尤为重要。
CGRP最早发现于甲状腺髓样癌组织中，主要分布于感觉神经纤维，通过轴浆运输到达神经末梢[11]。骨折发生后，随着骨折的愈合，周围神经逐渐长入骨折断端，其中以CGRP阳性纤维居多[12]。本研究通过基因转染方式，将外源性基因片段导入骨折断端，使其在体内表达。质粒溶液导入体内后转染效率虽然没有病毒溶液高，但由于CGRP在10-8～10-9 mol/L水平即能发挥作用，因此，本实验采用质粒溶液转染，是一种方便快捷的转染方式。A组CGRP在骨、骨膜、骨骼肌组织中的表达水平均明显高于B、C组，说明CGRP在体内转染成功并形成有效的表达。本研究A组CGRP在骨膜中的含量高于骨组织和骨骼肌组织，证明外源性CGRP在骨膜组织中的转染率高，这与内源性CGRP的分布水平相一致，是由于CGRP能够调节成骨细胞的活性，所以分布于骨膜等成骨活跃的区域[13]。术后2周时CGRP在骨膜内的含量明显高于4周时，说明CGRP主要在成骨的早期发挥作用，而在骨痂形成后的塑性期，其作用减弱。术后4周时，A组的CGRP表达仍较B、C组高，说明转染的外源性基因表达较持久。虽然B、C组没有外源性CGRP的转染，但在骨折愈合的早期和晚期仍有CGRP的表达，可见内源性CGRP在骨折周围组织中也有表达，而早期的表达水平高于晚期的动态变化，也说明了内源性CGRP在骨折愈合的过程中发挥一定的作用。CGRP发挥作用的通路可能与蛋白激酶C（PKC）有关[14]，也有研究表明其可能是通过抑制核因子κB活化因子配体（RANKL）对NF-κB的激活作用而起效[15]。本实验不足之处在于未能探究CGRP的具体作用通路及作用位点，尚需进一步研究。
综上所述，降钙素基因相关肽能够加速骨痂形成，提高骨折的愈合效率。
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（收稿日期：2013-07-05 本文编辑：程 铭）