HPLC同时测定余甘子叶中槲皮素和山奈酚的含量
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[摘要] 目的 建立hplc同时测定余甘子叶中槲皮素和山奈酚含量的方法。 方法 色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），梯度洗脱流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，流速：1.0 ml/min，检测波长：370 nm，柱温：30℃，进样体积：20 μl。 结果 槲皮素和山奈酚分别在0.003～0.06 μg/μl（r=0.9995）、0.001015～0.0203 μg/μl（r=0.9993）范围内呈良好的线性关系，平均回收率（n=6）分别为98.83%（RSD=2.73%）、101.58%（RSD=2.21%）。 结论 建立了同时测定槲皮素和山奈酚含量的方法，可进一步完善余甘子叶的质量控制体系。
[关键词] HPLC；余甘子叶；槲皮素；山奈酚
[中图分类号] R282 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（a）-0050-03
余甘子（Phyllanthus emblica L.）是大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）植物，是一味重要的传统民族药，已被载入多版中国药典[1]。余甘子不仅果实可入药，其种子、根、茎、叶、花亦可入药，如叶用于治疗水肿、皮肤湿疹、蛇咬伤、蜈蚣咬伤等[2-3]。随着药理学研究的展开，余甘子在抗菌[4]、抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、抗动脉粥样硬化[7-8]、抗乙型肝炎病毒[9]、保肝[10]、增强免疫[11-12]等方面的作用得到了进一步的认识。余甘子有多种化学成分，其中槲皮素和山奈酚为余甘子叶的活性成分[13]，本研究建立同时测定余甘子叶中槲皮素和山奈酚含量的方法，以期为进一步完善余甘子叶的质量控制体系提供依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
高效液相色谱仪：型号Agilent1100（含在线真空脱气机、高压四元梯度泵、标准自动进样器、智能化柱温箱、可变波长检测器、二极管阵列检测器）；Series色谱工作站（美国安捷伦科技公司）；SB3200T超声波清洗仪（上海能信超声有限公司）；LG16-W高速微量离心机（美国医用离心机厂）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯）；Millipore Simplicity-185超纯水器（美国密理博公司）。
1.2 试剂
槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100081-200406）；山奈酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：11081-200405）。余甘子叶样品经广西中医学院药用植物教研室刘寿养副教授鉴定。乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 实验条件的设定
色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速：1.0 ml/min，检测波长：370 nm，柱温：30℃，进样量：20 μl/次，梯度洗脱流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱程序见表1。理论塔板数以槲皮素和山奈酚峰计算应≥3000，分离度应>1.5，在此色谱条件下，样品分离良好，结果见图1。
表1 梯度洗脱时间程序表
图1 余甘子叶的HPLC色谱图
A.槲皮素峰；B.山奈酚峰
2.2 标准对照品溶液的制备
取槲皮素对照品约0.60 mg，精密称定，置于10 ml具塞容量瓶中，加100%甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，即得临时溶液。取山奈酚对照品1.02 mg，精密称定，置于50 ml具塞容量瓶中，精密加入上述临时溶液1 ml，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得。
2.3 供试品溶液的制备
取样品粉末约1 g，精密称定，置50 ml锥形瓶中，精密加入25 ml甲醇，称重，超声处理45 min，冷却，用甲醇补足损失的重量，再用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 线性关系的考察
取前述的标准对照品溶液5份，体积分别为0.5、2、4、8、10 ml；分别置于各自的10 ml容量瓶中，分别加甲醇至刻度，摇匀。吸取上述各溶液及2.2项下制备的标准对照品溶液各10 μl，按2.1项下的实验条件，注入色谱仪，进行测定。以峰面积Y作为纵坐标，进样浓度量X（μg/μl）作为横坐标绘制标准工作曲线，进行线性回归：槲皮素Y=3342X-17.70，r=0.9995；山奈酚Y=2986X-7.10，r=0.9993，线性范围分别槲皮素0.003～0.06 μg/μl，山奈酚0.001015～0.0203 μg/μl。
2.5 精密度试验
取2.2项下的标准对照品溶液20 μl，连续进样6次，对槲皮素和山奈酚的峰面积进行考察，其RSD分别为0.4%（n=6）、0.4%（n=6），所得结果显示所用仪器精密度好。
2.6 稳定性试验
取同一供试品溶液20 μl于同一天分别在0、1、2、4、6、12 h不同时间间隔点按选定的含量测定方法测定槲皮素和山奈酚，对所得的峰面积进行统计考察，其RSD分别为1.8%（n=6）、1.2%（n=6），试验结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验
取同一批样品6份各1 g，分别按前述方法制备成供试品溶液，按选定方法测定槲皮素和山奈酚的含量，结果槲皮素和山奈酚平均含量分别为0.6313、0.1159 mg/g，RSD值分别为1.7%（n=6）、2.1%（n=6）。
2.8 加样回收率试验
本实验采用标准添加法测定回收率：精密称定槲皮素和山奈酚各6份0.5 g（样品含量已知），分别精密加入甲醇15 ml，再精密加入前述配制的标准对照品溶液5 ml，其余操作按照2.3项下方法制备，并进样检测含量，结果见表2和表3。
表2 槲皮素加样回收率测定结果
表3 山奈酚加样回收率测定结果
2.9 样品测定
取样品粉末，按2.3项下方法制备各供试品溶液。按2.1项下条件进行测定，每个样品重复测定3次，外标法计算各样品中槲皮素和山奈酚的含量，结果见表4。
表4 样品含量测定结果
3 讨论
本实验采用的检测波长是在对对照品溶液进行紫外光谱扫描考察后，发现在370 nm处有较大的吸收，干扰较小，灵敏度较高，故选定检测波长为370 nm。
本实验还对流动相的选择进行了实验考察研究，遴选过乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水等多种溶液系统作为流动相，其中以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱的分离效果最好，因此选定该溶液作为含量测定的流动相。
本文比较了3个产地的余甘子叶中槲皮素和山奈酚的含量，其中槲皮素的含量以广西壮族自治区恭城县（0.6317 mg/g）最高，广西壮族自治区钦州市（0.1234 mg/g）的含量较低；其中山奈酚的含量以广西壮族自治区恭城县（0.1172 mg/g）最高，广西壮族自治区钦州市（0.03249 mg/g）的含量较低。
本实验建立了高效液相色谱法同时测定余甘子叶中槲皮素和山奈酚含量的方法，经方法学考察显示，该定量检测方法简便、准确、快速，稳定可行，重复性好，可作为控制余甘子叶质量的方法，也为评价余甘子叶质量提供了参考依据。
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（收稿日期：2014-05-12 本文编辑：李亚聪）