酶联免疫(STE)法检测血浆Hcy的应用研究

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【摘要】 目的 探讨血浆Hcy水平与脑血管疾病之间的关系,从而为脑血管疾病的防治提供参考性意见。方法对本院2008年3月至2009年5月收治脑卒中患者59例进行回顾性分析,用酶联免疫法测定血浆Hcy。结果 脑卒中组患者血浆Hcy显著高于对照组;脑梗死组和脑出血组患者血浆Hcy比较没有统计学差异;老年组与非老年组患者血浆Hcy比较无统计学差异;首发组患者血浆Hcy显著低于复发组。结论 血Hcy水平增高是脑卒中危险因素之一,酶联免疫法准确性高,可用于基层医院及实验室血浆Hcy浓度的检测工作及大宗临床病例的筛查。

【关键词】 酶联免疫;血浆Hcy;脑血管

作者单位:675400云南省楚雄州大姚县人民医院检验科

心脑血管疾病是危害人类生命的严重疾病之一,脑卒中是中老年人致残和认知障碍的主要原因[1]。目前已得到世界公认的高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、饮酒等是脑卒中发生的重要危险因素,控制这些危险因素可以预防脑血管疾病的发生。但近年的临床研究发现一些脑血管疾病患者并无上述危险因素。因此,需寻找新的脑血管疾病危险因素,提高对脑血管疾病发病机制的认识,制订新的防治策略则显得更为重要。1962年,Gerritsent等[2],Carson等[3],指出氨基酸代谢障碍致Hcy尿症患者血浆中Hcy积聚,并自尿中大量排出,形成Hcy尿,患者表现出智力发育迟滞及晶状体脱位。近年越来越多的研究表明,血中同型半脱氨酸( homocysteine, Hcy)含量的升高与脑动脉硬化及血栓的形成密切相关。本研究对本院2008年3月至2009年5月收治脑卒中患者59例进行回顾性分析,用酶联免疫法测定血浆Hcy,探讨血浆Hcy水平与脑血管疾病之间的关系,从而为脑血管疾病的防治提供参考性意见。

1 临床资料

1.1 一般资料 本院2008年3月至2009年5月收治脑卒中患者59例,男37例,女22例,诊断符合1995年第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准[4],经头部CT或MRI证实。入院3 d内病情稳定后完成神经功能缺损程度评分、脑梗死患者按OCSP脑梗死临床分型[5]。另选同15例非脑血管疾病患者作为正常对照组,男8例,女7例,年龄及性别与病例组比较无统计学差异(P>0.05),入选患者均排除心、肾、肝、代谢疾病及消化系统疾病、营养不良。

59例脑卒中患者,根据脑血管疾病类型,分为脑梗死组41例,脑出血组18例。按患者年龄,分为老年组(>60岁)35例,非老年组(< 60岁)24例。根据发病次数,分为首发组43例,复发组16例。41例脑梗死患者,按OCSP临床分型分为全前循环梗死(TACI)、部分前循环梗死(PACI)、后循环梗死(POCI)、腔隙性梗死(LACI)4个临床亚型。卒中患者按疾病程度分为轻型、中型、重型。记录患者的一般指标,如性别、年龄、既往史、入院血压、血糖、血脂、尿素氮、肌醉、血浆tHcy、脑梗死临床亚型。采用脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准[6]作为脑卒中严重程度的评价指标,分值越大,卒中程度越重,0-15分为轻型,16-30分为中型,31-45分为重型。

1.2 测定方法

受试者于入院次晨空腹抽取静脉血2 m1置于含5 % EDTA的试管中,冰浴,1 h内,2000 g离心15 min,取上层血浆,-20℃保存待检。采用酶联免疫( STE )法进行血Hcy浓度的测定。试剂盒购于上海康成生物工程有限公司(美国DIAZYME公司),采用国产DG3022A型酶联免疫检测仪,操作严格按说明书进行。同时记录患者血压及入院后的血糖、血脂、尿素氮、肌酐值。酶联免疫法基本原理是首先将Hcy还原,在样本中加入TCEP将氧化型Hcy还原成游离型Hcy,然后酶转换,加入SAH水解晦(SAHase)催化Hcy和腺苷反应生成SAH,加入SAHase抑制剂终止反应后,用腺苷酶(Adoase)降解残余腺苷除去干扰,由抗SAH单克隆杭体组成的竞争性酶联免疫检测系统定量测定样本中的SAH,用晦标仪在450 nm处测OD值。测定标准品不同浓度(2、5、10、15、30和60 μmol/L)OD值建立回归方程,将样本的OD值代入方程,得出样本的Hcy浓度。血浆thcy正常参考值为5~15 μmol/L,高于15 μmol/L为高同型半脱氨酸血症。

1.3 数据处理 应用统计学软件SPSS 13.0对所有数据进行分析。所有数据进行方差齐性检验及正态性分布检验,计数资料用频数表示,组间比较采用χ2检验。计量资料以均数士标准差(x±s)表示,两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较应用单因素方差分析。

2 结果

脑卒中组和对照组患者一般测定指标见表1。脑卒中组患者血浆Hcy显著高于对照组。

表1

患者一般情况统计表(x±s)

脑卒中组对照组

男378

女227

年龄61.6±12.360.3±11.5

空腹血糖(mmol/L)8.76±0.45*5.22±0.57

总胆固醇(mmol/L)4.73±0.524.86±0.45

低密度脂蛋白(mmol/L)2.78±0.252.84±0.20

高密度脂蛋白(mmol/L)1.04±0.41*1.52±0.51

甘油三酯(mmol/L)1.37±1.041.45±0.87

尿素氮(mmol/L)5.33±2.015.45±2.14

肌酐(mmol/L)84.27±24.92*65.34±19.76

血浆Hcy(μmol/L)16.44±6.50*7.85±3.68

注:*P

对不同分组患者的血浆Hcy值进行汇总,结果见表2。脑梗死组和脑出血组患者血浆Hty比较没有统计学差异,老年组与非老年组患者血浆Hcy比较无统计学差异,首发组患者血浆Hcy显著低于复发组。

表2

不同分组患者血浆Hcy

分组病例数血浆Hcy(μmol/L)

脑卒中组5916.44±6.50*

对照组157.85±3.68

脑梗死组4116.26±7.09

脑出血组1816.69±6.95

老年组3514.95±8.45

非老年组2415.20±7.33

首发组4312.59±8.26*

复发组1617.90±8.77

注:*P

3 讨论

同型半脱氨酸又称高半脱氨酸,是蛋氨酸代谢的中间产物,在人体内不能合成。蛋氨酸分子中含S甲基,在S-腺苷蛋氨酸合成酶作用下,与ATP结合生成S-腺苷蛋氨酸(SAH),后者供出甲基后,经脱水、脱腺苷生成S-腺苷和Hcy[7]。Hcy在体内可通过转硫基途径、甲基化途径、直接释放入细胞外基质,形成一定的Hcy学浓度。本研究从Hcy与脑卒中关系方面进行回顾性研究,以发现Hcy与脑卒中的关系以及与其他脑卒中危险因素的关系,为脑卒中的防治提供有意义的理论基础。研究结果表明,本组中脑卒中患者血浆Hcy明显高于正常对照组,说明Hcy升高与脑卒中发生存在着密切关系。而脑梗死组与脑出血组间血浆Hcy无明显差异,表明血浆Hcy水平可能与脑卒中类型无关。由于影响血浆Hcy水平的因素有很多。本研究中老年组与非老年组血浆Hcy并未显示出明显差异。近年来脑卒中发病率不断上升的同时,其复发率也在提高,脑卒中已逐渐成为威胁中老年人生命健康及生存质量的重要疾病之一,本研究发现,复发性脑卒中患者血浆Hcy明显高于首次发病患者,表明Hcy与可能是复发性脑卒中的一个重要危险因素。

测定Hcy的方法有放射酶分析法、气相色谱质谱分析法(GC-MS )、液相色谱质谱分析法(LC-MS )、HPLC-荧光检测法、HPLC-电化学法、毛细电泳法、酶联免疫法(ELISA)、荧光偏振免疫分析法(FPIA)和高效液相色谱分析法(HPLC),后三种方法是目前最常用的方法。HPLC法和FPIA法对检测仪器及技术要求高,检测成本高,不易在普通实验室及基层医院开展血Hcy浓度的检测工作。因此应用既简便,又准确实用的Hcy检测方法对临床上患脑卒中的患者进行检查及大宗健康人群的血Hcy普查就显得十分重要。本研究采用ELISA (STE)法对患者进行血Hcy测定,其优点是对样本无需预处理及色谱分析,操作简单,技术和设备要求不高,成本低,精密度和特异性高,检测速度快。

大规模的前瞻随机对照试验表明,逆转高Hcy血症治疗可使心脑血管病发病率及病死率降低。但引起血浆Hcy的因素有很多,基因水平的治疗目前比较困难,那么纠正其致病并促其恶化的因素-维生素缺乏便显得十分重要。研究显示,联合应用维生素B6、B12及叶酸能使95%高Hcy血症患者的血浆Hcy值降至正常范围[8],能有效的减少心脑血管疾病的发生。但是,这种治疗能否改变动脉粥样硬化的病理过程,以及补充维生素后的远期效果如何,停药后有无反复,尚需进一步研究。近年来,发现药物普罗布考是临床上最强的杭氧化药物,它能保护动脉内皮不受氧化损伤,防止平滑肌细胞向内膜迁移和增殖。如果该类药物在应用于Hcy导致血管内皮细胞损伤及平滑肌细胞增殖的拮抗试验中取得成功,则对于治疗高Hcy症具有潜在的临床应用价值。总之,血Hcy水平增高是脑卒中的一个危险因素,高Hcy血症的早期发现和早期纠正,可能会成为治疗和预防缺血性脑卒中的一个重要途径,血浆Hcy的测定将会与血脂、血糖一样成为脑血管疾病患者临床常规的检测项目。酶联免疫(STE)法准确性高,可用于基层医院及实验室血浆Hcy浓度的检测工作及大宗临床病例的筛查。

参 考 文 献

[1] 黄如训.脑卒中.人民卫生出版社,2001:2.

[2] Gerritsent T, Vaughn JG, Waisman HA.The identification of homocystine in the uine.Biochem Biophys Res Commun, 1962,9:493.

[3] Carson NAJ, Neill DW.Metabolic abnormalities detected in a survey of mentall backward individuals in Northern Ireland. Arch Dis Child, 1962,37:505.

[4] 中华神经科学会.中华神经外科学会.各类脑血管疾病诊断要点.中华神经科杂志,1996,29(6):379.

[5] Bamford J, Sandercock P, Dennis M, et al.Classification and natural history of clinically identifiable subtypes of cerebral infarction. Lancet, 1991,337(8756): 1521.

[6] 中华神经科学会,中华神经外科学会.脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准(1995).中华神经科杂志,1996, 29(6):381.

[7] Gauthier GM, Keevil JG, Mcbride PE. The association of homocysteine and coronary artery disease. Clin Cardiol, 2003,26:563.

[8] Conri C, Constans J, Parrot F, et al. Inverted question mark homocysteinemia: role in vascular disease. Press Med, 2000,29(13):737.