不同采收期青蒿黄酮和酚酸含量的动态变化研究

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[摘要] 目的 研究不同采收期青蒿中黄酮和酚酸类含量的动态变化规律，确定青蒿最佳采收期。 方法 通过正交试验设计，确定青蒿黄酮和酚酸类化合物的最佳提取条件，采用UV法，测定不同采收期青蒿中黄酮和酚酸类动态含量变化。 结果 不同采收期青蒿黄酮和酚酸类含量呈现规律性变化，即营养期>初花期>结实期>盛花期。 结论 如以黄酮和酚酸类化合物作为青蒿药材质量的指标性成分，则青蒿药材最佳采收期应为营养期，该结果为青蒿药材采收期的确定和质量评价提供一定的科学依据。

[关键词] 青蒿；黄酮；酚酸；最佳采收期

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（b）-0011-04

青蒿，属菊科植物黄花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分[1]，为一年生草本植物，全国均有分布，具有清虚热，除骨蒸，解暑热，截疟等多种药理活性。在临床上主要用于治疗疟疾、伤暑、潮热等症。化学成分主要包括：挥发油、香豆素、黄酮、萜类等，而以往对青蒿的研究大多集中在青蒿素及其衍生物的抗疟活性方面[2]，对其他成分研究较少。现代研究表明植物中黄酮与酚酸类化合物有保护心血管、抗肿瘤、抗病毒和抗人类免疫缺陷病毒等多种生物活性[3]。Shahidi等[4]和Bito等[5]分别在研究中提到：青蒿中酚酸类化合物具有抗菌、抗炎症和降低心脏病发病率等功效；而黄红英等[6] 研究青蒿中黄酮类化合物对猪油的氧化抑制，结果表明：青蒿中黄酮类化合物具有较高的抗氧化能力。目前，有关青蒿中黄酮及酚酸类化合物动态变化规律研究未见报道。因此，本研究采用乙醇超声提取技术和UV法对不同采收期青蒿中黄酮及酚酸类成分含量动态规律进行了研究，为青蒿最佳采收期的确定及青蒿规范化（GAP）种植提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AX-105 十万分之一天平；BP121S万分之一天平（德国赛托利斯公司）；XW-80A微型漩涡混合仪（上海沪西仪器厂有限公司）；SB-1000YDTD 超声清洗槽（宁波新芝科技股份有限公司）；微量多功能读板机（infinite M200）；96孔板（Cos96ft-Corning 96 Flat Transparent）。

1.2 试药

青蒿样品：营养期（2011-6 -24、2011-7-9、2011-7-24）、初花期（2011-8-11、2011-8-20、2011-8-25、2011-9-1、2011-9-5）、盛花期（2011-9-11、2011-9-15、2011-9-20、2011-9-25）和结实期（2011-10-10）（江苏康缘药业股份有限公司青蒿种植基地），芦丁、没食子酸（≥98%）标准品（成都曼斯特生物科技有限公司）；AlCl3、NaOH、亚硝酸钠、无水碳酸钠、无水乙醇均为分析纯（天津市北方天医化学试剂厂）；福林-酚试剂（1mol/L）（天津市光复精细化工研究所）；Milli-Q水。

2 方法与结果

2.1 样品预处理

将不同采收期青蒿药材自然晾干，80℃下隔夜烘至恒重，粉碎，过100目筛。

2.2 总黄酮的含量测定方法

2.2.1 芦丁标准品溶液的配制 精密称取芦丁1.00 mg置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，即得100 μg/mL的芦丁标准溶液。

2.2.2 标准曲线的绘制[7] 取芦丁标准溶液0、0.04、0.08、0.10、0.14、0.16 mL，分别放入5 mL容量瓶中，均加入0.02 mL 5%亚硝酸钠，涡旋混匀，静置6 min，再加入0.02 mL 10%硝酸铝，涡旋混匀，静置6 min，再加入0.1 mL 4%氢氧化钠，用60%乙醇定容至刻度，涡旋混匀，静置15 min，在510 nm处测定吸光度（A），获得回归方程：A=0.005C-0.001（r=0.9990）。

2.2.3 样品测定[7] 精确量取待测样品溶液0.1 mL置于5 mL干燥容量瓶中，按“2.2.2”项下操作，同时以60%乙醇作空白，测定总黄酮含量。用下式计算药材中总黄酮的含量：

y=■×V×n×100%

式中，y为青蒿中总黄酮的百分含量（%）；A为吸光度；V为提取液体积（mL）；n为稀释倍数；M为药材粉末质量（g）。

2.3 Folin-ciocalteu比色法测定总酚酸含量方法

2.3.1 没食子酸标准溶液的配制 精密称取没食子酸1.03 mg至10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即得103 μg/mL的没食子酸标准溶液。

2.3.2 标准曲线的绘制[8] 准确量取标准品溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.45、0.50 mL，分别放入5 mL干燥容量瓶中，加去离子水，0.25 mL福林试剂，涡旋混匀，加入0.75 mL 20%碳酸钠溶液，涡旋混匀，以去离子水定容至刻度。50℃水浴40 min。765 nm处测定吸光度（A）。获得回归方程：A=0.056C-0.010（r = 0.9990）。

2.3.3 样品测定[8] 精确量取待测样品溶液0.2 mL置于5 mL干燥容量瓶中，按“2.2.3”项下操作，同时以水作空白。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照。765 nm下测定吸光度（A）。用下式计算药材中总酚酸含量：

y=■×V×n×100%

式中，y为青蒿中总酚酸的百分含量（%）；A为吸光度；V为提取液体积（mL）；n为稀释倍数；M为药材粉末质量（g）。

2.4 样品提取条件优化

在超声辅助提取过程中，醇浓度、溶剂用量、提取时间等是影响植物药中有效成分提取的主要因素[9]。本研究选择了醇浓度（A）、料液比（药材与提取溶剂）（B）、提取时间（C）、提取次数（D）4个因素，采用L9（34）实验对样品的最佳提取条件进行了优化，各因素水平表。见表1。

为了探索适合两类成分最佳的提取方法，通过总黄酮和总酚酸赋予权重系数分别为0.5，采用综合评分的方法，确定最佳提取条件，结果见表2。

将正交实验结果进行方差分析，结果见表3。

通过综合评分直观分析表可知，各因素影响次序依次为：D>A>C>B；由表3方差分析结果表明：D因素的影响具有显著性意义（P < 0.05），A因素有一定的影响（P < 0.1），而B因素和C因素均无明显的影响。且B1和B3没有明显区别，为节省资源，因此确定最佳提取条件为：A3B1C3D2，即50%乙醇、料液比1∶70、超声时间50 min、提取次数2次。

2.5 方法学验证

2.5.1 重复性实验[10] 取取同一批样品5份，精密称定，分别按照“2.2.2”和“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，测定、计算总黄酮和总酚酸百分含量，RSD分别为1.50%、0.21%，表现重复性良好。

2.5.2 稳定性实验[10] 精密吸取同1份供试品溶液，分别在20、30、40、50、60 min测定、计算总黄酮和总酚酸含量，且RSD分别为1.19%和0.80%，表明60 min内该方法稳定性良好。

2.5.3 精密度实验[10] 按照“2.2.2”和“2.2.3”项下处理1份供试品溶液连续进针5次，总黄酮和总酚酸含量的RSD分别为2.77%和0.30%，表明该方法具有很好的精密度。

2.5.4 加样回收率实验[11] 精密称取0.0505 g已知含量的青蒿粉末6份，分别加入已知含量的芦丁对照品溶液；同时称取3份作为空白样，按照“2.2.2”和“2.2.3”项下处理试样溶液，测定总黄酮含量，计算回收率，平均值为102.1%，RSD=2.24%（n = 6）；以同样的方法测定没食子酸加样回收率，平均值为97.9%，RSD=1.03%（n = 6）。

2.6 不同采收期青蒿中黄酮和酚酸类化合物变化规律研究

利用所建立的分析方法，对不同采收期的青蒿样品中总黄酮和总酚酸含量进行了测定，结果见表4。

青蒿黄酮和酚酸在不同采收期含量累积呈现规律性的变化（图1），营养期>初花期>结实期>盛花期。因此，如以黄酮和酚酸为药用成分，青蒿最佳采收期应为营养期。

3 讨论

3.1 提取方式的优化

超声辅助提取与传统提取方式相比，因具有快捷、经济、高效、对有效物质损害小等优点而被广泛应用于中草药的分析研究中，因此，本研究利用正交实验优化青蒿总黄酮和总酚酸最佳超声辅助提取条件，并以黄酮和酚酸类化合物为指标，通过综合评分分析，确定出青蒿中黄酮和酚酸类含量均达最优的提取条件，在此最优提取条件下，若以黄酮和酚酸类为有效成分，对不同采收期的青蒿黄酮和酚酸类进行测定，来确定青蒿的最佳采收期。

3.2 不同采收期青蒿中黄酮和酚酸类含量的动态变化情况

研究结果表明，不同采收期青蒿中黄酮和酚酸含量，呈现出规律性变化，且变化规律具有一致性，即营养期>初花期>结实期>盛花期。从图1可以看出，不同采收期青蒿中黄酮和酚酸类的含量变化很大。徐文燕等[12]在研究中报道：紫外辐射、高光强、低温、高CO2浓度、适度干旱等因素均可促进此类成分的合成。其中光照和温度是两大影响因素，可以直接影响到合成途径中关键酶的活性，对植株中黄酮和酚酸类成分的含量具有明显的调节作用。本研究不同采收期青蒿中黄酮和酚酸类含量的动态变化规律与上述研究结果具有一致性。

3.3 青蒿药材最佳采收期的确定

青蒿中黄酮和酚酸类在不同采收期含量动态变化规律研究表明营养期为黄酮和酚酸类化合物含量最高时期，因此，仅以黄酮和酚酸类作为其有效成分，营养期青蒿药材的质量最好，可作为青蒿的最佳采收期。本研究为青蒿黄酮和酚酸类化合物进一步开发利用提供实验数据，为确定青蒿药材最佳采收期和规范化种植提供科学依据。

综上所述，青蒿不同采收期黄酮和酚酸类化合物含量呈现规律性变化，即营养期>初花期>结实期>盛花期。如以黄酮和酚酸类化合物为指标，青蒿药材最佳采收期应为营养期。

[参考文献]

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[12] 徐文燕，高微微，何春年.环境因子对植物黄酮类化合物生物合成的影响[J].世界科学技术-中医药现代化，2006，8（6）：68-71.

（收稿日期：2012-11-23 本文编辑：卫 轲）