真核表达载体pEGFP―N1―kin17的构建及其在Zmpste24―/―小鼠胚胎成纤维细胞内的表达
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[摘要]目的 构建人kin17基因真核表达载体pegfp-n1-kin17，将载体转染至野生型及Zmpste24基因缺失的小鼠胚胎成纤维上皮细胞，荧光显微镜观察kin17蛋白表达情况。 方法 用高保真DNA 聚合酶，从pCMV-kin17载体中扩增获取人kin17 cDNA编码序列，将其克隆至pEGFP-N1载体中，经酶切、连接、转化后，挑取阳性克隆进行菌液进行PCR、菌液质粒双酶切及测序鉴定；将成功构建的GFP-kin17表达载体转染Zmpste24-/- MEFs，荧光显微镜观察kin17蛋白的核定位情况。 结果 pEGFP-N1-kin17转化细菌克隆测序结果完全正确；将载体转入MEFs后，可以通过荧光显微镜观察到kin17蛋白的表达。 结论 成功构建GFP融合的kin17真核表达载体，该载体为kin17蛋白的研究提供工具。本实验中载体pEGFP-N1-kin17在野生型和Zmpste24-/- MEFs中均成功表达。
[关键词] kin17；GFP；Zmpste24；小鼠胚胎成纤维细胞
[中图分类号] R346 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）13-34-05
[Abstract] Objective To construct the kin17 GFP fusion eukaryotic expression vector and explore the expression and location of kin17 in Zmpste24-/- mouse embryonic fibroblasts （MEFs）. Methods cDNA fragment of kin17 was amplified from pCMV-kin17 by PCR and cloned into GFP fusion eukaryotic expression vector pEGFP-N1. The positive clone was confirmed by sequencing. Zmpste24-/- and wild type MEFs were obtained from 13.5 d pregnant Zmpste24+/- female mouse. The recombinant plasmid was transiently transfected into Zmpste24-/- MEFs with LipofectamineTM2000. The protein expression of kin17 was detected by fluorescence microscopy. Results Eukaryotic expression vector pEGFP-N1-kin17 containing coding region of human kin17 gene was successfully constructed. Zmpste24-/- and wild type MEFs were identified by PCR and western blotting genotyping. Zmpste24-/- and wild type MEFs transfected with the recombinant plasmid expressed high level of recombinant kin17 protein was detected by fluorescence microscopy. Conclusion The construction of pEGFP-N1-kin17 was successfully achieved and the expression of GFP-kin17 was located in the nucleus of Zmpste24-/- and wild type MEFs.
[Key words] kin17； GFP； Zmpste24； Mouse embryonic fibroblasts
Kin17（from immunological kinship to Rec A Protein，clone17）蛋白是一种普遍表达的白，从酵母到人均可检测到kin17蛋白的表达。Kin17蛋白与DNA直接结合，参与DNA合成；同时kin17也具有和RNA直接结合的结构，类SH3（src homology 3）的结构域，因此kin7可能是细胞核内功能调节的重要蛋白质。Kin17在细胞增殖期表达量最高[1-4]。在DNA损伤因素处理后，kin17蛋白的表达量明显上调，提示kin17蛋白可能参与DNA损伤修复，因此它被称为应激蛋白[5]。本研究小组前期通过酵母双杂交方法，以lamin A为诱饵蛋白，从人骨骼肌文库中钓取相互作用蛋白。Kin17为其中之一的阳性克隆。通过内源性免疫共沉淀，我们再次验证了kin17和lamin A是相互作用蛋白。 Zmpste24 [Zinc Metallopeptidase（STE24 Homolog，Yeast）]，是lamin A蛋白成熟过程中必须的基质金属蛋白酶。Zmpste24敲除（Zmpste24-/-）模型小鼠因不能顺利剪切lamin A前体prelamin A蛋白，造成体内大量prelamin A堆积，导致小鼠产生许多以早老表型为主的病理特征。在Zmpste24-/-细胞水平，则观察到细胞核异常、基因组不稳定性等病理现象[6-8]。本实验构建pEGFP-N1-kin17，并将载体转染Zmpste24-/-小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts， MEFs），为进一步深入探讨kin17和lamin A的相互关系建立了一个有效的细胞实验模型。
1 材料与方法
1.1 MEFs分离和传代
孕13.5 Zmpste24+/-雌小鼠由香港大学周中军教授馈赠。实施断颈法处死孕小鼠，无菌条件下取出小鼠胚囊，逐一分离，置于3.5cm的培养皿中。除去胚胎头部及内脏组织后（收取部分做基因型鉴定），每个胚胎加入1mL胰蛋白酶-EDTA后用眼科剪将组织剪碎，并在37℃孵育约15min。随后将细胞组织悬液转移至一个15cm培养皿中，加入20mL含10%胎牛血清的DMEM培养液，终止胰酶消化，在培养箱中过夜培养，次日更换培养基。细胞长到80%～90%汇合时并仍处于指数生长期时，冻存细胞或将细胞传代。传代时弃去培养液，PBS缓冲液清洗细胞，1mL 5%胰酶-EDTA 37℃消化5min。随后加入上述DMEM培养液5mL，轻轻吹打细胞，使细胞脱离培养皿表面，离心回收细胞后，可根据实验将细胞13至15稀释移至新的培养皿中，或用血球计数板计数，接种相应的细胞数量至实验所需的不同的细胞培养皿中，加入适量培养液在37℃ 5%CO2培养箱培养。
1.2 MEFs基因型鉴定
1.2.1 基因水平鉴定方法 PBND法[50mM KCl，10mM Tris-HCL（pH8.3）， 2.5mM MgCl2， 0.1mg/mL gelatin， 0.45%（v/v） Nonident P40，0.45%（v/v） Tween 20]溶解收取的部分小鼠胚胎组织，加入蛋白酶K（20mg/mL），55℃过夜。次日沸水煮样本5min，离心取上清1～5?L作为PCR模板。PCR引物：共同上游引物GTCTCCTCGTGATGTCACAACTTTG，野生型下游引物GGAGCGGATCTCAAA CTCTCCTC，突变型下游GAATCCAAACATGACCTTCCCCT。反应条件按照Taq DNA Polymerase（Takara）说明书进行，具体为：94℃ 10s，60℃15s，72℃ 30s，30 Cycles。
1.2.2 蛋白水平鉴定方法 1.1培养的MEFs中取部分细胞，胰酶消化收集细胞，1×PBS清洗细胞，离心回收细胞后加入含蛋白酶抑制剂（Merck）的RAPI 裂解缓冲液（0.5% Nonidet P-40，150 mM NaCl，100mM DTT and 50 mM Tris-HCl，pH 8.0）在冰上裂解细胞。细胞裂解液加入蛋白上样缓冲液后在沸水中加热样品3min使蛋白变性。制备SDS-PAGE胶，每孔上样10μL进行电泳分离蛋白，将凝胶上的蛋白电转移至PVDF膜（Millipore），5%脱脂牛奶封闭剂，室温孵育1h；加入15 000稀释的laminA/C （H-110）多克隆抗体（Santa Cruz）室温孵育2h；加入15 000稀释的HRP二抗（Bethyl），室温孵育1h。最后加入ECL发光试剂于PVDF膜上，用X光片曝光及显影定影，获得结果。
1.3 人Kin17原核表达载体的构建和鉴定
引物设计与PCR：扩增人kin17 cDNA序列上游引物：上游 CGCGGATCCATGGGGAAGTCGGATT，酶切位点为BamHI；下游 CCGCTCGAGTCAGGCAAGTTTAG AAATG，酶切位点为XhoI。由上海生工合成。以法国 Angulo F.教授馈赠pCMV-kin17质粒为模板。反应条件按照PrimerSTARTM HS DNA Polymerase（Takara）说明书进行，具体为：98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 1min，30 Cycles。按PCR片段纯化试剂盒（上海生工）说明书将PCR扩增片段进行纯化，取纯化的Kin17 PCR扩增产物和pEGFP-N1质粒DNA进行BamHI和XhoI限制性内切酶酶切反应。再次纯化酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行DNA连接，16℃反应16h。将连接产物的转化入感受态大肠杆菌DH10B。含氨苄青霉素（50mg/mL）的LB琼脂平板上涂布菌液，37℃倒置培养12～16h，观察到单菌落形成。挑取小部分菌落作为模板，再次进行相同PCR，将PCR反应电泳确证后的重组子克隆寄到上海生工测序。
1.4 质粒转染MEFs
将18mm×18mm无菌盖玻片置于6孔板中，接种1×106 MEFs细胞在盖玻片上，过夜培养，次日转染pEGFP-N1-kin17入MEFs。转染试剂为Lipofectamine2000（Life），参考试剂说明书进行操作。配制A液：500?L OPTI Medium（Life）加入4?g质粒，B液为500?L OPTI Medium加入10?L Lipofatemine 2000。指尖轻弹管壁混匀，室温静置 5min。将 A 液和B液 相加并混匀，室温静置20min后，使用移液器轻轻滴加到培养MEFs的6孔板中，轻轻摇动 6孔板，混匀转染混合液，将6孔板放回培养箱。转染4～6h后更换新鲜培养基。
1.5 荧光显微镜观察GFP-Kin17表达情况
转染24h后PBS缓冲液洗MEFs 2次，4%PFA固定细胞10min，PBS缓冲液洗Hela细胞3次，10min/次。每个盖玻片的细胞加约10?L SlowFade? Gold antifade reagent with DAPI 的封片剂，小心将盖玻片放在载玻片上，四周封上少许透明指甲油。待样品风干片刻，即可进行荧光显微镜观测。也可将玻片暂存于-20℃或-80℃冰箱，观测前取出即可。
2 结果
2.1 pEGFP-N1-kin17质粒的构建
pEGFP-N1载体全长为4700bp，人kin17全长为1182bp。人kin17的PCR产物两端分别加上酶切位点和保护碱基，长度为1200bp。1%的琼脂糖电泳可以看到pEGFP-N1-kin17 BamHI /XhoI双酶切后的小片段DNA与PCR的DN段大小相同与预期片段大小一致，而pEGFP-N1-kin17单酶切的载体比单酶切空载体pEGFP-N1片段略长，同样与预期片段一致。因此，琼脂糖凝胶电泳证实pEGFP-N1-kin17成功构建，见图1A。挑取经BamHI/XhoI双酶切反应，凝胶电泳分离，证实成功构建的载体克隆，在1mL的LB培养液中过夜培养，送菌液样品到上海生工生物有限公司测序。通过互联网 www.ncbi.nlm.nih.gov，打开BLAST，输入测序获得的序列信息，进行序列比对分析，正向测序部分结果见图1B。
2.2 荧光显微镜观察 kin17在MEFs中定位
MEFs是原代细胞，pEGFP-N1和pEGFP-N1-kin17分别转染野生型和Zmpste24-/- MEFs，荧光显微镜观察细胞，见图2。其中，第1列为检测绿色荧光获得的图像。在野生型和突变型两种细胞中GFP空载体转染均可见GFP蛋的表达。无论是在野生型还是突变型，GFP单独转染对照细胞中均可见GFP分布于整个细胞中，包括细胞核与细胞浆。而GFP偶联Kin17的转染的细胞中，GFP荧光信号则绝大部分在细胞核内呈均匀分散态，并在细胞核中出现较多密度较高的聚集。第2列为UV通道检测DAPI染细胞核图像，细胞核清晰可见，形态正常，均匀分布。第3列为第1和第2列图像的叠加。
3 讨论
Lmna基因通过不同的剪接过程表达lamin A/C蛋白（A型核纤层蛋白）。A型核纤层蛋白Lamin A/C与DNA的复制，转录，翻译以及表观遗传学修饰等事件密切关联[6]。关于kin17的研究发现并不多，目前认为，kin17与DNA复制起始点密切结合；与非复制起始点比较，kin17与复制起始点DNA的结合力强10倍。kin17通过与T抗原相互作用，结合于SV40的DNA复制起点。由此可见，kin17在DNA复制过程中与DNA复制起始关系更为密切。免疫电镜也证实kin17与DNA复制相关蛋白质RPA，PCNA，和DNA聚合酶 α 等共定位[9-10]。可见，kin7与lamin A的关联值得深入研究探讨。我们通过Zmpste24-/-小鼠小鼠模型获得Zmpste24基因缺失的MEFs，以此作为lamin A相关机制及早老症相关机制研究的优先细胞模型。我们希望能在Zmpste24-/-小鼠中表达GFP-kin17以建立一个新的便于研究kin17和lamin A关系的细胞模型。
本实验通过运用PCR法，从质粒中将人kin17 cDNA扩增，并将其成功插入pEGFP-N1载体中，经测序验证，成功构建pEGFP-N1-kin17载体。同时，我们成功从孕13.5d Zmpste24+/-雌小鼠中获得MEFs。并通过抽提基因组DNA进行运用PCR法进行基因型鉴定，其中E1，2，3，5为杂合子，E4为突变纯合子，E6为野生型，见图2A。随后运用免疫印迹方法将E6和E4的MEFs在蛋白水平进行基因型鉴定，图2B可见E4 中lamin A的蛋白条带明显比E6的高，表明分子量变大，提示该MEFs克隆的lamin A前体蛋白无Zmpste24剪切，仍以prelamin A形式存在，该结果与PCR法获得的基因型鉴定结果是一致的。将MEFs种于6孔板后，通过脂质体转染的方法，将pEGFP-N1空载体和pEGFP-N1-kin17载体导入野生型和Zmpste-/- MEFs活细胞内。荧光显微镜观察到，GFP蛋白在野生型和Zmpste24-/- MEFs中均为遍在表达，包括细胞浆和细胞核，提示GFP在MEFs中成功表达[11]。同时转染了pEGFP-N1-kin17载体的野生型和Zmpste-/- MEFs细胞中，GFP标记的kin17只在细胞核内表达，这与其他实验室在不同细胞株中的实验结果一致[5]，提示本实验成功构建pEGFP-N1-kin17载体，并能在野生型和Zmpste-/- MEFs细胞中成功表达GFP-kin17。此时Zmpste24-/- MEFs中GFP-kin17的定位并无异常。可见异常prelamin A堆积，对kin17 的核内定位未造成显著影响，我们在镜下未见kin17有定位异常或出现明显聚集体。是否这是因为本实验选用的是第二代的年轻态的MEFs细胞，此时基因缺失MEFs和野生型MEFs表型差异不够大 ？或者提示lamin A与kin17相互作用的功能关系，有可能是存在于某些信号传导通路（或电离辐射或UV照射）产生的DNA损伤等其他特定应激事件中？两者间的表达相互作用机制，还有待进一步借助Zmpste24-/-? MEFs模型开展深入研究。
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（收稿日期：2014-05-15）