针灸对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜形态学及GH IGF-I表达的影响

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马晓　桑小宁　吴焕淦　施　征　刘慧荣　王晓梅

摘　要：目的：探讨针灸大肠下合穴上巨虚对溃疡性结肠炎(UC)大鼠肠黏膜形态学及生长激素(gh)、胰岛素样生长因子－I(IGF－I)表达的作用。方法：采用免疫法加局部刺激制备UC大鼠模型，随机将大鼠分为模型组、隔药灸组、电针组，并与正常大鼠作对照。隔药灸组、电针组选取上巨虚穴分别进行隔药灸、电针治疗，连续治疗14次。治疗结束后采用光、电镜观察肠黏膜形态学变化；应用免疫组化法检测结肠GH、IGF－I蛋白表达。结果：UC大鼠结肠光镜观察可见溃疡形成和炎症，电镜观察可见结肠黏膜上皮细胞绒毛脱落短小缺损，胞膜损伤。线粒体肿胀，嵴消失，高尔基体囊泡较少，杯状细胞膜严重受损，胞内没有黏液颗粒；结肠GH、IGF－I蛋白表达增高。隔药灸组、电针组经过治疗后，结肠黏膜病理损伤减轻；结肠GH、IGF－I蛋白表达降低，趋于正常。结论：隔药灸、电针上巨虚穴均能明显改善UC大鼠结肠黏膜病理损伤，保护肠黏膜，促进肠黏膜机械屏障的修复：UC大鼠结肠GH、IGF－I表达增高，隔药灸、电钟上巨虚穴均能促进结肠异常增高的GH、IGF－I的表达趋于正常。

关键词：溃疡性结肠炎；肠黏膜；生长激素；胰岛素样生长因子

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1362－04

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)又称慢性非特异性溃疡性结肠炎，是一种反复发作的原因不明的肠道慢性非特异性炎症和溃疡性病变，本病病位主要在大肠黏膜及黏膜下层，病理表现以溃疡糜烂为主，多累及远端结肠，亦可遍及全部结肠。在其反复发作过程中还可导致肠道纤维化和狭窄的形成。而且UC患者的结、直肠癌的发病率也显著高于一般人群。研究表明，UC的发生、发展与肠黏膜屏障功能长期慢性的损伤有密切关系，UC患者肠黏膜屏障的各个环节包括物理屏障、化学屏障、免疫屏障、生物屏障，都存在着不同程度的损伤。生长激素/胰岛素样生长因子－l(growth factor－insulin Hke growth factor．GH/IGF－I)轴的调节功能在肠黏膜屏障损伤过程中具有重要的作用。本试验旨在从形态学角度观察针灸大肠下合穴上巨虚对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障损伤的影响，探讨溃疡性结肠炎大鼠结肠GH/IGF－I轴的变化及针灸上巨虚的干预作用，为“合治内腑”理论提供实验依据。

1　材料与方法

1．1　实验动物

由上海中医药大学实验动物中心提供的雄性SD大鼠共40只(质量合格证号：沪医动证字05号)，体重(1加±20)g，随机分为造模组(30只)和正常组(10只)。

1．2　模型制备

参照《药理实验方法学》，应用免疫学方法，并加局部刺激制备溃疡性结肠炎大鼠模型。采用溃疡性结肠炎患者术后新鲜结肠黏膜，加适量生理盐水制成黏膜匀浆，冷冻24h，冻溶后以3000r/min离心30min，取上清液提纯测定蛋白质含量，并与Freund佐剂混合配成乳剂。造模组大鼠首次每只足趾内注射抗原6mg，并在10、17、24、31天分别于足趾、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原12mg(末次注射不加Freund佐剂)。至血清抗结肠抗体达到一定效价，对造模组大鼠用2％戊巴比妥钠30mg/kg体重行腹腔麻醉，用3％福尔马林2mL灌肠，留置1h，以生理盐水洗净后排出，再用抗原液(12mg/mL不加佐剂)2mL灌肠，留置2h，洗净排去。正常SD大鼠为正常组，用生理盐水做与造模组相同处理。

造模结束后，分别随机选取正常组2只、造模组大鼠6只，作HE染色确定模型是否成功。在确定模型制备成功的基础上，将造模组大鼠随机分为模型组、隔药灸组和电针组。

1．3 分组与治疗

1．3．1 正常组正常大鼠，做与隔药灸组相同的固定。

1．3．2 模型组不作任何治疗，只做与隔药灸组相同的固定。

1．3．3 隔药灸组取穴上巨虚。穴位定位根据《实验针灸学》(林文注，1994年)。药饼配方：附子、肉桂等。艾炷：大小约90mg。每日隔药饼灸1次，每次每穴灸2壮，连续治疗14天。

1．3．4 电针组取穴上巨虚。穴位定位同隔药灸组。用韩氏神经穴位刺激仪，深度0.2－0.3cm，疏密波，频率2/50Hz,20mins，每日1次，连续治疗14天。

治疗结束后，将正常组、模型组、隔药灸组、电针组大鼠颈椎脱位处死，剖开腹腔，割取远端结肠2－3cm，用于指标检测。

1．4　检测指标与方法

1．4．1　形态学观察HE染色，光镜观察组织病理学变化；透射电镜观察大鼠结肠黏膜屏障超微结构的变化。

1．4．2　结肠组织GH IGF－I蛋白表达检测免疫组化，图像分析。具体操作步骤：结肠组织常规脱水、透明、石蜡包埋和切片，将4μm石蜡切片贴在涂有切片黏合剂的载玻片上，58℃烤24h，常规脱蜡至水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10min，无水乙醇、95％、85％、75％乙醇各2min，水洗。O.01mol/LpH7.4 PBS洗3min×3次，1％H2 O2作用20min，PBS洗3min×3次，抗原修复1Omin×2次[将切片置于0.01moL/LpH6.0柠檬酸缓冲液中，微波Ⅲ档(98℃)10min×2次]，自然冷却至室温，PBS洗3min×3次，1％正常血清室温封闭20min，不洗，加适当稀释一抗，4℃，18h，PBS洗3min×3次，Envision试剂30min37℃，PBS洗3min×3次，0.04％DAB+0.03％H202显色8min，水洗，苏木素衬染30s，水洗，盐酸乙醇蓝化2s，水洗，微波蓝化，常规树脂封片。图像分析采用IbiS细胞图像分析系统(上海申腾信息技术有限公司)。

1．5　统计学处理

数据用均数±标准差(x±s)表示，运用$PSS13.0统计软件进行统计学分析，用one way ANOVE检验进行单因素方差分析，方差不齐时用Games Howell分析。

2　结　果

2．1　形态学观察结果

(1)光镜观察结果：光镜下可见正常组大鼠结肠黏膜上皮完整，可见由单层柱状(结肠)上皮、固有层和黏膜肌层组成的肠腺排列规整。模型组大鼠结肠黏膜缺损，腺体被破坏或消失，杯状细胞减少，黏膜固有层可见炎性细胞浸润，隐窝上皮增生，并有隐窝炎及隐窝脓肿形成。在黏膜固有层可见较多微血栓形成，肉芽组织、胶原纤维增生。经过隔药饼灸、电针治疗后，病情均有不同程度的减轻，溃疡表面有上皮细胞覆盖，炎症细胞减少，可见少量肉芽组织。(2)UC大鼠结肠黏膜屏障超微结构的变化：电镜下可见正常大鼠结肠黏膜上皮细胞绒毛排列整齐，胞膜完整，线粒体正常；模型大鼠结肠黏膜上皮细胞绒毛脱落短小缺损，胞膜

损伤，线粒体肿胀，嵴消失，高尔基体囊泡较少，较多的是吞噬泡，杯状细胞膜严重受损，而且胞内没有黏液颗粒，组织间还有渗出的红细胞和嗜酸性粒细胞；经隔药灸、电针上巨虚治疗后大鼠结肠黏膜上皮细胞绒毛长度多数正常且排列整齐，胞膜完整，线粒体嵴正常，高尔基体旁有大量的囊泡，杯状细胞内充满黏液颗粒。

2．2　针灸对UC大鼠结肠GH表达的影响

表1所示：GH集中表达于结肠上皮层、固有层。溃疡性结肠炎大鼠模型GH光密度值、阳性表达面积百分比显著增高(均P

2．3 针灸对UC大鼠结肠IGF－I表达的影响

表2所示：IGF－I主要表达于结肠上皮层、固有层。溃疡性结肠炎大鼠模型IGF－I光密度值、阳性表达面积百分比显著增高(P

3　讨　论

中医学中无“溃疡性结肠炎”的专属名词，依据其主要临床表现，可将之归属于中医学的“泄泻”、“肠”、“腹痛”、“休息痢”等范畴。上巨虚穴是足阳明胃经穴位，为大肠下合穴，不仅具有调节胃肠功能的作用，还具有补虚、理血、理气、化湿等功效，是治疗肠腑病的要穴。“合治内腑”理论出自《灵枢・邪气脏腑病形》，根据“合治内腑”理论大肠腑有病当取之下合穴上巨虚。本实验建立大鼠溃疡性结肠炎模型，观察隔药灸、电针上巨虚穴对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜形态学的影响，旨在从形态学角度为“合治内腑”理论提供实验依据。 。

本实验结果显示：模型组光镜下可见大鼠结肠黏膜缺损，腺体被破坏或消失，杯状细胞减少，黏膜固有层可见炎性细胞浸润，隐窝上皮增生，并有隐窝炎及隐窝脓肿形成。在黏膜固有层可见较多微血栓形成，肉芽组织、胶原纤维增生。提示结肠有溃疡形成和炎症，UC模型制备成功。对模型组肠黏膜屏障超微结构的观察可见结肠黏膜上皮细胞绒毛脱落短小缺损，胞膜损伤，线粒体肿胀，嵴消失，高尔基体囊泡较少，较多的是吞噬泡，杯状细胞膜严重受损．而且胞内没有黏液颗粒，组织间还有渗出的红细胞和嗜酸性粒细胞。提示结肠黏膜屏障结构破坏。经过隔药饼灸、电针上巨虚治疗后，UC大鼠结肠病理改变均有不同程度的减轻，光镜下可见溃疡表面有上皮细胞覆盖，炎症细胞减少，可见少量肉芽组织。电镜下见结肠黏膜上皮细胞绒毛长度多数正常且排列整齐，胞膜完整，线粒体嵴正常。高尔基体旁有大量的囊泡，杯状细胞内充满黏液颗粒。结果提示：隔药灸、电针上巨虚穴均能够明显改善UC大鼠肠黏膜组织学改变，促进溃疡修复和炎症吸收，保护肠黏膜，促进肠黏膜机械屏障的修复。

GH/IGF－I轴是体内重要的合成代谢调节系统。人体GH是由脑垂体前叶含有嘈酸性颗粒的GH分泌细胞分泌，在体内GH与IGF－I形成GH/IGF－1轴而发挥作用。一方面GH与靶细胞上的GH受体相结合，刺激肝脏及豚道IGF/－I的生成；IGF－1则直接作用于靶细胞，介导GH的生物效应。另一方面IGF－I又在垂体前叶或丘脑下部水平负反馈调控GH的分泌。IGF在肠道病理生理中扮演双重角色，当IGF－I正常表达时可以营养肠道，通过刺软细胞分裂和胶原沉积促进伤后愈合；反之，若IGF－I表达过度则导致肠道肿瘤、腺癌和纤维化。若IGF－1分泌适当，能促进损伤的修复，是组织损伤愈合的必需成份；胃肠道黏膜广泛存在着GH受体，体外培养显示GH直接促进肠黏膜细胞产生IGF－I，以自分泌、旁分泌方式发挥作用，使肠黏膜增厚，平滑肌体积增大，肠长度增长。若IGF－I在肠道局部分泌过度，会导致胶原的过度沉积。肠纤维化的发生。IGF－I以旁分泌和自分泌方式介导因炎症过度愈合所致肠纤维化，GH/IGF－I轴是导致肠纤维化的重要机制之一。此外，IGF的过度表达与肿瘤的发生发展也有密切关系，人体多种肿瘤组织内IGF和或IGFR的表达明显高于正常组织，研究发现在大肠癌中IGF－I、IGF－IR大量表达。

本实验观察了UC大鼠结肠GI－I/IGF－I轴的变化及针灸上巨虚的干预作用，结果显示：UC大鼠GH、IGF－l主要表达于结肠上皮层、固有层。UC大鼠模型结肠GH、IGF－I光密度值、阳性表达面积百分比均显著增高，结合形态学观察提示UC大鼠结肠组织存在肠纤维化或肠纤维化趋势，而其癌变的风险也较正常增高。经过隔药灸、电针上巨虚穴治疗后GH光密度值及阳性表达面积百分比均趋于正常，与模型组比较差异均有统计学意义，与正常组比较差异均无统计学意义IGF－I光密度值及阳性表达面积百分比均显著下降，其中光密度值与正常组比较差异均无统计学意义。隔药灸、电针上巨虚对GH、IGF－I的作用比较差异没有统计学意义。结果提示电针、隔药灸均能促进UC大鼠结肠异常增高的GH、IGF－l表达趋于正常；电针、隔药灸上巨虚穴通过调节UC大鼠结肠GH、IGF－I的表达。可能起到一定的防治肠纤维化和预防结肠癌变的作用。