天麻提取物作为流感疫苗佐剂的免疫效果及安全性
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[摘要] 目的 探讨天麻提取物作为流感疫苗佐剂的免疫效果及安全性。 方法 将BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只。天麻提取物佐剂组：含血凝素1.8 μg，天麻提取物0.2 mg；氢氧化铝佐剂组：含血凝素1.8 μg，氢氧化铝佐剂0.2 mg；单独疫苗组：含血凝素1.8 μg；空白对照组：注射生理盐水0.2 mL。采用腿部肌内注射方式分别于0、21 d免疫2次，每次0.2 mL/只。自初次免疫开始，每隔7 d收集血清，测定小鼠血凝抑制抗体效价。初次免疫后7 d内，每天称量一次小鼠体重，监测各组小鼠的体重变化。 结果 天麻提取物佐剂组各时间点的血凝抑制抗体效价显著高于单独疫苗组、空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；天麻提取物佐剂组与氢氧化铝佐剂组初次免疫后7、28 d的血凝抑制抗体效价比较，差异有统计学意义（P < 0.05），提示其能提前产生免疫增强效果。各组组内不同时间点的血凝抑制抗体效价比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组小鼠初次免疫后7 d内体重变化差异无统计学意义（P > 0.05），注射部位未见不良反应产生。 结论 天麻提取物作为疫苗佐剂，具有良好的安全性，且佐剂效果明显，有望成为流感灭活疫苗的新型免疫佐剂。
[关键词] 流感疫苗；佐剂；天麻；提取物
[中图分类号] R93；R392-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（a）-0004-04
流感是实行全球性监测的传染病，具有传播速度快、传染性强等特点[1]。目前预防流感最主要的手段是接种疫苗[2]。对潜在的大流行性流感病毒的各种疫苗的研究和开发应用，是大流行防备计划的一个重要举措之一[3]。佐剂加入流感疫苗中能够增强疫苗的免疫原性，降低抗原的用量[4]，扩大流感疫苗的生产数量[5]。
天麻（Gastrodia elata Bl.）属兰科植物，其干燥块茎入药，气微，味甘。具有熄风止痉，平抑肝阳，祛风通络的功效。可用于治疗小儿惊风、癫痫抽搐、破伤风、头痛眩晕、手足不遂、肢体麻木和风湿痹痛等[6]。现代研究表明天麻具有增强特异性抗体生成以及细胞免疫应答的功能[7]。
本研究首次选取天麻提取物作为灭活H3N2流感疫苗佐剂的效果，并与氢氧化铝佐剂对照组、疫苗组的佐剂效果进行比较，为其作为流感疫苗佐剂的可行性及安全性提供参考。
1 材料与方法
1.1 动物及材料
清洁级BALB/c小鼠，雄性，28日龄，体重18～22 g，由中国医学科学院（北京协和医学院）医学生物学研究所（以下简称“我所”）动物中心提供，动物许可证号：SCXK（滇）2010-0003，合格证号：53002100000006；实验前将小鼠置于常温动物房中，饲养1周。流感病毒为H3N2A/Victoria/210/2009NYMC X-187，来源于WHO/NIBSC。H3N2流感病毒灭活疫苗单价原液为本实验室制备及保藏（血凝素含量为126 μg/mL）。天麻[来源于昭通天麻，昆明道地中药饮片厂惠赠，经昆明天紫江药厂工程师冯波（国家中药学职业药师）鉴定为Gastrodia elata Bl.）；氢氧化铝佐剂（浓度为14 mg/mL）由我所制备；受体破坏酶（receptordestroying enzyme，RDE）购自日本Seiken公司。
1.2 方法
1.2.1 天麻提取物制备 取天麻粉末100 g，以液料比10∶1加入60°C的蒸馏水1000 mL，超声波破碎仪提取20 min后离心，上清液过滤后进行冷冻干燥，即为天麻提取物。
1.2.2 动物分组及免疫 将小鼠随机分为4组，每组10只。天麻提取物佐剂组：注射含血凝素1.8 μg，天麻提取物0.2 mg的疫苗0.2 mL[8]；氢氧化铝佐剂组：注射含血凝素1.8 μg，溲趸铝0.2 mg的疫苗0.2 mL；单独疫苗组：注射含血凝素1.8 μg的疫苗0.2 mL；空白对照组：注射生理盐水0.2 mL。分别于0、21 d免疫2次，每次经腿部肌内注射，0.2 mL/只。
1.2.3 各组免疫效果检测 于初次免疫后每隔7 d采集小鼠尾动脉血，分离血清，检测血凝抑制抗体效价[9]，连续检测6周。
1.2.4 天麻提取物作为流感疫苗佐剂对小鼠生长情况的影响 自初次免疫之日起，连续7 d，每天称量1次小鼠体重，记录小鼠体重变化，通过对小鼠体重变化的统计分析，看天麻提取物佐剂组小鼠体重与其他对照组有无差异，并观察小鼠注射部位有无不良反应出现，从而初步评价天麻提取物佐剂的安全性。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组内不同时间点的比较采用重复测量数据的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 天麻提取物的佐剂效果
天麻提取物佐剂组各时间点的小鼠血清血凝抑制抗体效价均高于单独疫苗组，从抗体效价趋势图（图1）中可明显看出两组差距较大。在不同时间点，天麻提取物佐剂组与单独疫苗组比较差异有统计学意义（P < 0.05），说明天麻提取物作为流感疫苗佐剂具有较好的佐剂效果。在初次免疫后的第7天及第28天，天麻提取物佐剂组与氢氧化铝佐剂组比较差异有统计学意义（P < 0.05），而其他时间点比较差异无统计学意义（P > 0.05），可初步表明该提取物佐剂的免疫增强作用先于氢氧化铝佐剂组产生。在抗体最高即初次免疫后35 d时，天麻提取物佐剂组与氢氧化铝佐剂组比较差异无统计学意义（P > 0.05），说明在抗体产生峰值时，天麻提取物佐剂与氢氧化铝佐剂效果相当；35 d后，各组抗体水平回落，于初次免疫后42 d时，天麻提取物佐剂组与氢氧化铝佐剂组趋于一致。见表1、图1。
对组内不同时间点的血凝抑制抗体效价进行统计分析，球形检验结果显示差异有统学意义（P< 0.05），不满足球形分布假设，对其进行多变量方差分析以及自由度调整后，统计结果显示，时间因素（即初次免疫后7、14、21、28、35、42 d）的差异有统计学意义（P < 0.05），说明各时间点的血凝抑制抗体效价比较差异有统计学意义；时间因素分组的差异有统计学意义（P < 0.05），表明时间因素和分组之间具有交互作用，不同时间点的血凝抑制抗体效价随着分组的不同而不同。多组间整体比较显示各组的差异有统计学意义（P < 0.05）；组间两两比较结果显示天麻提取物佐剂组与氢氧化铝佐剂组之间的差异无统计学意义（P > 0.05），而与其他组之间的比较差异有统计学意义（P < 0.05），进一步说明天麻提取物具有较好的佐剂效果，且与氢氧化铝佐剂效果相当。
2.2 天麻提取物对小鼠生长情况的影响
对小鼠在初次免疫后7 d内的体重变化数据进行统计分析[F=1.451，F 0.05]，表明各组小鼠体重增长变化差异无统计学意义。对于天麻提取物佐剂组与其他各组之间进行多重比较，差异无统计学意义（P > 0.05），表明天麻提取物佐剂组体重变化与其他组之间差异无统计学意义。见表2。观察注射部位，未发现明显不良反应现象，从而初步证明，此天麻提取物佐剂具有良好的安全性。
3 讨论
据估计，全球每年有300万～500万例严重的流感病例，造成250 000～500 000例死亡，给人类的生命安全及社会的经济发展带来严重的威胁[10]。流感病毒具有多种亚型，且变异性强[11]，目前一些流感抗病毒药物可用于重症流感住院或一些流行病的早期阶段[12]。在流感疫苗研究中，改进现有疫苗技术，佐剂的研究仍然是其中重要的一步；尽管水包油型的乳佐剂MF59能够增加婴儿季节性流感的免疫反应，但是，面对健康的成年人、老年人和免疫低下的人群却不能起到相同的功效[13]。因此研发出一种良好的疫苗佐剂以应用于流感疫苗，对于流感疫苗的足量供应以应对疫情暴发具有重大意义[14]。
我国中草药资源丰富，其作为疫苗佐剂具有毒性低、免疫原性低、能够降解等优点，而成为近几年疫苗佐剂研究的一个热点[15]。目前研究较多的是中草药提取多糖佐剂、皂苷佐剂、菊粉佐剂等。从台湾紫芝中提取的多糖PS-F2能够在体外刺激树突状细胞产生促炎性细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6、IL-12和IL-23以及表达成熟的CD40、CD80和CD86分子；其作为佐剂进行体内实验能够诱导Th1激活的适应性免疫反应，用于疫苗中能够有效抵抗病毒和肿瘤[16]。从酸浆果实成熟的茎中用碱提取出的水溶性酸性杂多糖（WSPA），其用作DNA疫苗（pd-hsp90c）免疫小鼠能够显著增强小鼠特异性抗体IgG、IgG1、IgG2b抗体滴度[17]。一种新的基于三角菊粉微粒多糖佐剂用于灭活甲型H1N1疫苗可以帮助解决新生儿免疫反应低下的问题，其用于幼犬及幼鼠能够显著增强体液免疫及细胞免疫[18]。QS21，一种来自于皂树的天然皂苷，由两个同分异构体组成，是目前很有发展前景的佐剂之一，已被应用于许多临床实验中[19]，但由于其毒副作用以及作用分子机制不清楚等而限制了其进一步应用[20]。从中草药中筛选出一种可用的疫苗佐剂具有较强的可行性及重要性，仍有许多种类的中草药有待进一步开发及应用。
本实验选取了天麻提取物进行动物实验，检测其作为流感疫苗佐剂的效果。实验结果表明，天麻提取物具有良好的佐剂效果，能有效提高血凝抑制抗体效价，可减少抗原用量，并增强免疫效果，而其抗体产生的时间也较铝佐剂更早、更快。且天麻提取物没有对小鼠的生长状况产生明显的影响，对注射部位也未发现有不良反应产生，可作为安全有效的新型疫苗候选佐剂，并为相关的药物开发和临床应用提供了依据。关于天麻提取物的免疫增强机制及对不同疫苗的佐剂效果仍需进一步研究。
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（收稿日期：2016-07-28 本文编辑：李亚聪）