四川道地产区乌头药材不同部位6种生物碱含量对比研究
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摘要 目的：研究四川道地产区6种乌头生物碱在不同部位的分布差异，比较母根、子根基于化学成分的区别。方法：采用超高效液相色谱法（UPLC）测定19批四川道地乌头药材母根、子根、须根中6种乌头生物碱含量，并结合SPSS统计软件对数据进行显著性差异、聚类分析和主成分分析研究。结果：6种乌头生物碱在3个部位的分布差异各不相同。母根、子根中苯甲酰新乌头碱、新乌头碱含量有显著性差异，为两者的差异性指标成分。聚类分析、主成分分析也将供试样品分成母根、子根两大类。结论：母根、子根的物质基础有差别，可为临床正确使用提供参考。
关键词 UPLC；乌头；母根；子根；乌头生物碱；区别
收稿日期 2013-03-15
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2013zx09402202）
通信作者 *冯锋，教授，E-mail：
作者简介 钱长敏，硕士研究生，主要从事药材资源的研究，Tel：15902245166，E-mail： 毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.为一常用毒性药用植物。药典收录的相关药材有川乌和附子。两者分别为乌头的母根和子根[1]。虽然药典已明确了药用部位，但川乌和附子的混用还是较多。课题组在终端药材市场采购时发现川乌除有母根之外，许多为小子根，附子的生药材多为大个子根，这与之前文献报道一致[2]。近年来，已有针对乌头不同组织的多项研究，包括毒性、化学成分的比较等[3-7]。其中乌头生物碱研究较多，主要比较了总生物碱和3种双酯型生物碱的差别，但未见有单酯型生物碱的含量差异研究。四川江油为乌头药材的道地产区，有着悠久的种植历史，其年产量占了全国乌头药材很大的比重。本文建立了超高效液相色谱法（UPLC）测定江油多批次乌头样本母根、子根、须根中6种乌头生物碱含量，比较研究江油6种乌头生物碱在不同根部的分布差异，同时结合聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA），系统探讨母根与子根基于6种乌头生物碱的区别，以期通过多样本量多化学成分来评价四川道地产区药材质量和根部组织的差异，为已有化学成分研究提供补充，为母根、子根在临床的正确合理使用提供更多的参考依据。
1 材料
1.1 仪器
超高效液相色谱系统（ ACQUITY UPLC，美国Waters公司，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、TUV检测器、Empower2工作站），电子天平（XS205，瑞士METTLER TOLEDO公司），粉碎机（MF10，德国IKA公司），高速冷冻离心机（ST16R，美国Thermo公司），平行溶剂蒸发仪（Q-101，瑞士BUICH公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。
1.2 药品与试剂
苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱（纯度和批号分别为99.6%，111795-200901；96.5%，111794-201102；99.5%，111796-200901；100%，110799-200505；100%，110720-200410；99.5%，110798-200805；均购于中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；醋酸铵（优级纯，天津市光复科技发展有限公司）；碳酸氢铵（优级纯，天津市元力化工有限公司）；醋酸（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；异丙醇、醋酸乙酯（分析纯，天津市化学试剂二厂）；氨水（分析纯，天津市化学试剂三厂）；超纯水（Milli-Q制备）。
1.3 药材样本采收
乌头药材样本于2012年6月底（产区采收季）实地采自道地产区四川江油，在当地不同种植区域共收集19批样本，主要为根部及与根部相连少部分茎叶。除去泥沙，晒干，将根部分为母根、子根、须根，备用。19批药材样本经天津大学药物科学与技术学院高文远教授鉴定，均为毛茛科植物乌头A. carmichaelii，样品标本保存于天津天士力集团研究院现代中药研究所，样本信息见表1。
表1 19批乌头药材样本信息
Table 1 The sources of 19 batches of Aconitum carmichaelii
注：每个样本均含有母根、子根、须根。
2 方法
2.1 对照品溶液的制备
取苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品适量，精密称定，加0.1% 醋酸甲醇至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为372.8，61.2，130，602.4，70.4，1 102.4 mg·L-1的混合对照品储备液，存储于4 ℃冰箱中备用。
2.2 供试品溶液的制备
分别取各样品粉末（过3号筛）2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-醋酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz，水温在25 ℃以下）30 min，放冷，再称重，用异丙醇-醋酸乙酯（1∶1）混合溶液补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.1% 醋酸甲醇溶液3 mL溶解，转移至离心管中，于12 000 r·min-1下高速离心10 min，取上清液，即得。
2.3 超高效液相色谱条件
ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A 30 mmol·L-1 NH4AC水溶液（氨水调pH 10.0），流动相B 乙腈；洗脱梯度：0～1.5 min，28%乙腈，1.5～2.8 min，28%～38%乙腈，2.8～5.5 min，38%乙腈，5.5～7.0 min，38%～60%乙腈，7.0～10 min，60%～28%乙腈；检测波长235 nm；柱温40 ℃；进样量2 μL；对照品及样本（包括母根、子根、须根）的UPLC图见图1。
1. 苯甲酰新乌头碱；2. 苯甲酰乌头碱；3. 苯甲酰次乌头碱；4. 新乌头碱；5. 乌头碱；6. 次乌头碱。
图1 混合对照品（A）和乌头母根（B）、子根（C）、须根（D）UPLC图
Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances （A） and mother root （B）， daughter root（C）， fibrous root （D） of Aconitum carmichaelii
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察 取混合对照品储备液适量，用0.1% 醋酸甲醇稀释成6个系列浓度对照品溶液，按2.3项下色谱条件进行测定。以对照品溶液质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程和线性范围，结果见表2。
表2 6种乌头生物碱的回归方程和线性范围
Table 2 The regression equation and linear range of six aconitum alkaloids
注：r均为0.999 9。
2.4.2 精密度试验 取混合对照品溶液，按2.3项下色谱条件连续进样6次，计算苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为0.34%，0.17%，0.19%，0.24%，0.15%，0.21%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验 取CH-14样本子根粉末2 g，精密称定，按2.2项下操作，平行制备6份供试品溶液，按2.3项下色谱条件进行分析，计算苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱含量的平均值（n=6）分别为0.104，0.015，0.042，0.251，0.050，1.004 mg·g-1 ；RSD分别为1.8%，1.9%，1.5%，2.0%，1.9%，0.94%，表明重复性良好。
2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温放置，按2.3项下色谱条件分别在0，2，4，6，8，10，12 h进样分析，计算苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为0.43%，1.8%，1.5%，0.44%，1.8%，0.47%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.4.5 检测限与定量限 通过不断稀释对照品溶液，进样测定，确定检测限（S/N=3∶1）和定量限（S/N=10∶1）。测得苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的检测限分别为0.149，0.019，0.047，0.231，0.011，0.113 mg·L-1，定量限分别为0.497，0.068，0.159，0.786，0.042，0.403 mg·L-1。
2.4.6 加样回收率试验 取已知含量（CH-14样本子根）样品6份，每份1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样分析，计算加样回收率，结果见表3。
表3 6种乌头生物碱的加样回收率（n=6）
Table 3 The recoveries of six aconitum alkaloids（n=6）
续表32.5 样品测定
分别取各样品粉末2 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液。按2.3项下色谱条件进行分析，外标法计算含量，结果见表4。
表4 19批乌头样本母根、子根、须根中6种乌头生物碱质量分数（n=2）
Fig.4 The contents of six alkaloids in the three parts of Aconitum carmichaelii（n=2）mg·g-1
注：1.苯甲酰新乌头碱；2.苯甲酰乌头碱；3.苯甲酰次乌头碱；4.新乌头碱；5.乌头碱；6.次乌头碱。
3 结果与分析
3.1 6种乌头生物碱在3种根部的含量对比
根据表4中的数据结果，计算6种乌头生物碱在母根、子根、须根中总体含量均值，并基于均值做出分布和含量对比图，具体见图2，3。
虽然母根、子根、须根均为地下部分，且相互附着生长，但从图中可以看出，6种生物碱在3个部位的分布还是有差别，且相互之间的差异也不同。母
A.苯甲酰新乌头碱；B.新乌头碱；C.苯甲酰乌头碱；D.乌头碱；E.苯甲酰次乌头碱；F.次乌头碱。
Fig.2 The distributions of six aconitum alkaloids in the three parts
图3 6种乌头生物碱在3种根部的含量对比图
Fig.3 The comparisons of six aconitum alkaloids in the three parts
根与子根中多种生物碱含量大致相同，只有苯甲酰新乌头碱、新乌头碱差异较大，但须根在多种成分上与前两者有较大差别，突出体现在苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱、乌头碱和次乌头碱。
3.2 母根与子根的对比分析
3.2.1 母根、子根中6种乌头生物碱含量的显著性差异分析 为明确母根、子根中6种乌头生物碱之间的差异，采用SPSS 19.0统计软件，对两部位中 6种生物碱进行统计学显著性差异分析。通过Shapiro-Wilk正态分布检验，苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在母根、子根中含量均呈正态分布，且Levene检验显示5种成分在2个部位中方差齐性，则采用t检验进行显著性差异分析。结果显示苯甲酰新乌头碱、新乌头碱显著性均小于0.05，表明两者在母根、子根中存在显著性差异，而其他3种乌头生物碱差异不明显。乌头碱由于Shapiro-Wilk检验显示数据不呈正态分布，则采用Kolmogorov-Smirnov非参数检验。结果显示显著性大于0.05，表明乌头碱在两根部也无显著性差异。
3.2.2 系统聚类分析 以上述母根、子根共38个供试品的6种乌头生物碱含量及各成分含量比值为变量，采用SPSS 19.0统计分析软件中离差平方和法（Ward法），利用欧式距离平方（squared euclidean distance）作为样品测度，对38个供试样品进行系统聚类分析，结果见图4。
图4 母根、子根系统聚类
Fig.4 The results of hierarchical cluster analysis of mother and daughter roots
从聚类图可以看出，38份样品被分为2类，除个别样本的母根、子根中6种生物碱含量接近，未能聚类分开。其余基本按照母根、子根聚类，聚类结果与形态学结果基本一致。
3.2.3 主成分分析 在聚类分析的基础上，对原变量进行主成分分析。以特征值大于1为提取标准，得到2个主成分PC1和PC2，累积贡献率为73.85%，其中PC1贡献57.62%，PC2贡献16.23%。根据主成分分析原理，取前2个为主成分基本可以说明各指标的所有信息。PC1主要反映了苯甲酰新乌头碱含量、新乌头碱含量、苯甲酰新乌头碱与次乌头碱含量比、新乌头碱与次乌头碱含量比以及乌头碱与次乌头碱含量比，PC2主要反映了苯甲酰新乌头碱与乌头碱含量比，由此也论证了苯甲酰新乌头碱、新乌头碱为母根、子根的差异性指标成分。
根据2个主成分（PC1，PC2）的得分系数，计算每个样本PC1，PC2的得分变量值，并绘出PC1，PC2得分变量的散点图，见图5。
图5 样品2个主成分得分变量散点图
Fig.5 The scatter diagram of the first two principal components of all samples
从图5可以看出，38个样品被分为2组，即母根与子根，同时在母根组中有少量子根样品，子根组中也混有母根样品，其分组结果与聚类分析结果一致。
4 讨论
本文建立UPLC方法同时测定了母根、子根、须根中6种乌头生物碱含量。待测成分在10 min内即可完全基线分离，较HPLC方法大大缩短了分析时间，尤其适用大样本量分析。
有关乌头生物碱的色谱分析研究很多，其中乙腈-醋酸铵体系[8-9]较为常用。在已有研究的基础上，作者对该体系进行了具体考察，包括pH、不同缓冲盐以及不同缓冲盐浓度，其中苯甲酰次乌头碱、次乌头碱由于Pka较大等因素，发现两者的保留时间随着pH增大而增大，但随着缓冲盐浓度增大而减小。经过比较摸索，确定以30 mmol·L-1 NH4AC（氨水调pH 10.00）溶液-乙腈为流动相。该流动相试剂简单、缓冲盐浓度低、易挥发，相较于药典法可直接用于LC-MS的分析。
本研究在多样本量的基础上，分析比较了四川产区6种生物碱在3种根部的分布情况，数据客观且具有统计学意义，能够反映道地产区乌头药材的质量，且在不同部位的含量分布也可为具体次生代谢途径的阐明提供帮助。
针对母根与子根的差别，对乌头碱的含量进行了统计学对比研究。6种乌头生物碱在两根部的显著性差异比较，明确指出了苯甲酰新乌头碱、新乌头碱含量有显著性差异。基于化学成分量的聚类分析，将38个供试样品分成了2大类，大致与生药鉴定结果相同，说明聚类分析适用于母根与子根的区分，也反应两部位是有区别的。主成分分析是研究如何将多指标转化为新的既彼此互不相关又具有较强的信息凝聚效能的综合指标。其结果与聚类分析结果基本一致，表明主成分分析能进一步验证聚类分析结果的准确性，并且也证明了苯甲酰新乌头碱、新乌头碱为母根、子根的差异性指标成分。
以上结果说明，基于化学成分量的角度，母根、子根的物质基础是有区别的。结合已有毒性差异、多糖类成分差异等，可指出两根部在使用时不能混用。但如需指出两者的药效区别，还有待结合具体的使用情况进行药效学评价才能佐证。
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Difference evaluation of three kinds of root of Aconitum carmichaelii in
Sichuan based on UPLC analysis of six alkaloids and chemometrics
QIAN Chang-min， SONG Zhao-hui， ZHANG Lan-lan， ZHOU Shui-ping， FENG Feng（1. China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China；
2.Traditonal Chinese Medicine R&D Institute of Tasly Academy， Tianjin Tasly Group Co.， Ltd.， Tianjin 300410， China）
[Abstract] An ultra performance liquid chromatography （UPLC） method was established and validated to simultaneously determine the contents of six aconitum alkaloids in mother， daughter and fibrous roots of 19 batches of Aconitum carmichaelii from Sichuan province. The separation of the six alkaloids was achieved on a ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） column at 40 ℃ with a mobile phase consisting of acetonitrile in 30 mmol·L-1 ammonium acetate buffer solution（adjusted to pH 10.0 with aqueous ammonia）in gradient mode. The data and plots showed that the six aconitum alkaloids have different distributions. Four aconitum alkaloids were almost same in mother and daughter root except benzoylmesaconine and mesaconitine， while the fibrous root differed from the other two roots. The comparisons of significant differences of six aconitum alkaloids between the mother and daughter roots definitely demonstrated that benzoylmesaconine and mesaconitine were the representative components. The 38 detecting samples were classified as two clusters by hierarchical clustering analysis （HCA） and principle component analysis （PCA）， the results indicated that the mother root was different from the daughter root on chemical material basis. The study might contribute to the reasonable clinical application of A. carmichaelii.
[Key words] UPLC； Aconitum carmichaelii； mother root； daughter root； aconitum alkaloids； differences
doi：10.4268/cjcmm20131705