金叶子异槲皮苷对MC3T3―E1细胞成骨分化的影响
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[摘要]该研究对从金叶子中分离得到的异槲皮苷的成骨活性进行了系统评价。在1×10-4，1×10-5，1×10-6， 1×10-7 mol・L-1异槲皮苷浓度作用下检测了mc3t3-e1细胞增殖活力和碱性磷酸酶活性；在异槲皮苷作用的第3天对MC3T3-E1碱性磷酸酶、I型胶原以及转录因子Runx2和Osterix的基因表达水平进行了检测；并通过茜素红染色的方法在第21天对MC3T3-E1进行了胞外基质矿化能力的评价。结果显示，异槲皮苷在1×10-7～1×10-5 mol・L-1能促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化及矿化能力，上调成骨相关基因的表达，而且该作用呈现出一定的浓度依赖性，在浓度为1×10-6 mol・L-1时促进作用最强。在1×10-4 mol・L-1时表现出明显的细胞毒性。因此，从金叶子中分离得到的异槲皮苷有一定的成骨活性，这可能是传统中药金叶子治疗骨折的主要药效成分。
[关键词]异槲皮苷；MC3T3-E1细胞；增殖；成骨分化
传统中药防治骨质疏松和骨折创伤的主要有效成分为黄酮类化合物[1-5]。这类化合物与雌激素结构相似，因其具有良好的类雌激素作用及较低的副作用，而广泛用于雌激素的替代治疗[6]。云南金叶子是一种民间常用中草药，主要用于治疗风湿关节痛，跌打损伤，骨折等[7]，但其治疗骨相关疾病的药效成分并未明确。异槲皮苷（槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷）是云南金叶子中的主要黄酮类化合物之一[8-9]。研究表明，异槲皮苷有抗菌，抗氧化及抗神经炎性作用[10-12]，但其成骨活性的研究却未见报道。为此，本实验选择了金叶子中的天然活性成分异槲皮苷，以MC3T3-E1细胞为干预对象，研究了异槲皮苷对细胞增殖、成骨分化功能的影响，为金叶子用于骨创伤疾病的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 MC3T3-E1细胞株（中国协和细胞库），改良型α-MEM培养基（Hyclone公司），澳洲胎牛血清、1%的青霉素/链霉素双抗试剂、0.25%胰酶（Gibco公司），CCK-8试剂（北京同仁化学所），碱性磷酸酶试剂盒（abcam公司），DMSO、茜素红、抗坏血酸钠、β-甘油磷酸钠、地塞米松和氯化十六烷基吡啶（Sigma），反转录试剂盒（ToYoBo公司），实时荧光定量PCR试剂盒（Roche公司，瑞士）。将异槲皮苷（纯度>99%，由昆明理工大学植物化学实验室分离鉴定）溶于DMSO，配制成10 g・L-1的溶液，再用培养基稀释成1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol・L-1的工作溶液。
1.2 MC3T3-E1细胞培养 使用含10%胎牛血清、1%双抗的改良型α-MEM培养基于37 ℃，5%CO2培养箱中培养MC3T3-E1细胞，每3 d换液，传代培养至细胞数量达到实验所需时进行以下的实验。
1.3 CCK-8检测 取对数生长期的MC3T3-E1细胞，0.02% EDTA+0.1%胰蛋白酶消化， 制备单细胞悬液，调整浓度以5×104个/mL密度接种于96孔板，每孔100 μL，接种量为5 000个/孔。培养24 h后，分别以浓度为1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol・L-1的异槲皮苷工作液处理细胞，含DMSO[
1.4 碱性磷酸酶染色 将细胞按2×104个/孔接种于48孔板中，24 h后换含1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol・L-1异槲皮苷培养基，用成骨诱导剂（含1×10-7 mol・L-1地塞米松，50 mg・L-1坏血酸，10 mmol・L-1的β-甘油磷酸）作为阳性对照（OS），DMSO为阴性对照。第7天吸取上清液做ALP定量检测，按碱性磷酸酶定量试剂盒说明书操作，室温避光孵育1 h后在405 nm处测A。同时将吸去培养基的细胞用PBS清洗3次，然后用70%的乙醇固定30 min，BCIP/NBT染色10 min后加入ddH2O终止反应，再加入ddH2O清洗至溶液无色，晾干后拍照。
1.5 RT-PCR检测 以1×105 个细胞/孔接种于6孔板中。培养24 h后换含1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol・L-1异槲皮苷培养基。于第3天收集各组细胞，加入1 mL Trizol试剂裂解细胞，提取总RNA，利用反转录试剂盒将1 μg RNA反转为cDNA，使用实时荧光定量PCR试剂盒和7500 Real Time PCR 仪进行RT-PCR反应，检测ALP，ColI，Runx2及Osterix的基因表达水平。各基因引物序列见表1。通过2-ΔΔCt计算各基因相对表达量。进行3次独立重复实验。
1.6 细胞外基质矿化染色及定量 以4×104个细胞/孔接种于24孔板中，24 h后换为同时含1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol・L-1异槲皮苷及OS的培养基，OS为阳性对照，DMSO为阴性对照。每3 d换液，培养至21 d时，弃去培养基，用PBS 清洗3次，70%乙醇固定30 min，1%的茜素红（pH 4.2）染色30 min，ddH2O清洗至溶液无色，晾干后拍照。用10%的氯化十六烷基吡啶溶液，室温溶解1 h，620 nm处测A。
1.7 统计学分析 使用SPSS 19.0 统计软件对实验结果进行数据分析，采用单因素方差分析各组值，以P
2 结果
2.1 细胞形态观察 1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol・L-1异槲皮苷作用1 d后，细胞形态饱满，与正常细胞无差别，说明这3个浓度不影响细胞的正常生长。而1×10-4 mol・L-1作用下的细胞出现皱缩，飘浮，细胞数目较少，表现出明显的细胞毒性，见图1。
2.2 MC3T3-E1细胞增殖 1×10-4 mol・L-1异槲皮苷对细胞增殖表现出明显的抑制作用，而在1×10-6 mol・L-1条件下， 1，3，5，7 d均能促进细胞的增殖，1×10-5 ，1×10-7 mol・L-1在5，7 d表现出促增殖的作用，差异有统计学意义，见图2。
2.4 成骨分化相关基因表达 培养3 d后，1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol・L-1异槲皮苷分别上调了MC3T3-E1细胞ALP基因表达的 3.3，3.9，3.6倍， ColI 基因表达的1.5，1.8，1.1倍， Runx2基因表达的1.3，1.5，1.0倍，以及Osterix基因表达的1.2，1.5，1.1倍。1×10-6 mol・L-1浓度上调最明显，结果有统计学差异，见图4。
2.5 细胞外基质钙结节形成 1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol・L-1异槲皮苷与OS协同促进细胞外基质矿化，产生较多的钙结节。从定量结果看，1×10-6 mol・L-1组的作用强于其他2个浓度组，差异有统计意义，见图5。
3 讨论
本实验系统评价了异槲皮苷对前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化功能的影响。结果显示，异槲皮苷在高于1×10-5 mol・L-1时表现出明显的MC3T3-E1细胞毒性，在1×10-5～1×10-7 mol・L-1表现为促进作用，推测可能与药物本身的毒性有 关。此结果与Jun-Jun Fan等的研究结果类似，他们发现淫羊藿苷作用于人骨髓间质干细胞的适宜浓度为1×10-9～1×10-6 mol・L-1，高于1×10-5 mol・L-1就表现出明显的细胞毒性，且淫羊藿苷的促成骨分化作用有浓度依赖性，最佳作用浓度为1×10-6 mol・L-1 [13]。本研究也得出了类似的结果，异槲皮苷对MC3T3-E1细胞的促增殖及分化作用有一定的剂量依赖性， 1×10-6 mol・L-1异槲皮苷在整个检测时间内均有较明显的促进作用，明显优于1×10-5 ，1×10-7 mol・L-12个浓度。
碱性磷酸酶ALP是参与骨代谢的重要蛋白质，是骨钙化的主要调节酶，在细胞分化过程中，碱性磷酸酶的活性可以代表成骨细胞的早期分化水平[14-16]。 细胞外基质成熟，矿化形成钙结节是成骨细胞成熟的标志。异槲皮苷能促进MC3T3-E1细胞的成骨分化，增加ALP的分泌及钙结节的产生，促进作用的结果表现为1×10-6 mol・L-1>1×10-5 mol・L-1 >1×10-7 mol・L-1。Runx-2 和Osterix 是成骨性分化的重要转录因子。Runx-2能诱导细胞成为软骨细胞或成骨细胞，而Osterix能刺激前成骨细胞成为成骨细胞[17-18]。笔者研究了异槲皮苷对Runx-2 和Osterix mRNA表达的影响，发现1×10-6 mol・L-1对这2个基因的表达上调了1.5倍，说明能促进MC3T3细胞的成骨转化；ALP，ColI是骨形成的重要指标，1×10-6 mol・L-1对这2个基因的表达分别上调了3.9，1.8倍，说明能促进成骨基因的表达，从而促进骨形成。
本实验从细胞及分子水平检测了不同浓度异槲皮苷对成骨前体细胞MC3T3活性及成骨分化调控的影响。发现异槲皮苷对MC3T3细胞的活性有促进作用，并起到了促进成骨分化的作用，说明异槲皮苷很可能是金叶子具有成骨活性的主要药效成分。金雀异黄酮的成骨构效关系研究认为，C7和C4′位上的羟基是其雌激素样作用的重要基团，相当于雌二醇3位和17位上的羟基。由于金雀异黄酮这2个羟基间的距离与雌二醇等同，使得金雀异黄酮以类似雌二醇的亲和力与雌激素受体结合[19]。本研究中的异槲皮苷亦在C7和C4′位上有羟基，故推测异槲皮苷可能是通过雌激素样作用发挥促成骨分化的作用。本研究为金叶子用于跌打损伤和骨折治疗提供了实验依据，期望为其治疗骨创伤相关疾病提供科学解释，为开发可用于骨再生治疗的中药单体提供依据。
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Effects of isoquercitrin from Craibiodendron yunnanense on osteogenic
differentiation of MC3T3-E1 cells
DUAN Ai-zhu1，2， DENG Xu-liang2， LI Rong-tao1*
（1.Faculty of Life Science and Technology， Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， China；
2.Department of Geriatric Dentistry， Peking University School and Hospital of Stomatology， Beijing 100081， China）
[Abstract] Natural products especially flavonoids are being explored for their therapeutic potentials in reducing bone loss and maintaining bone health. The present study is to investigate the effects of isoquercitrin from Craibiodendron yunnanense with different concentrations at 1×10-4， 1×10-5， 1×10-6， 1×10-7 mol・L-1 on proliferation， differentiation and mineralization of MC3T3-E1. Cell proliferation was assessed by CCK-8 kit at 1， 3， 5 and 7 days of culture. Alkaline phosphatase （ALP） activity were performed qualitatively and quantitatively on day 7， and alizarin red S staining was employed to access the mineralization of cells on day 21. The osteogenic markers ALP， collagen type I （COL 1A1）， runt-related transcription factor 2 （Runx-2） and Osterix were detected to analysis early osteogenic differentiation of cells on day 3 by RT-PCR. The results showed that isoquercitrin had a dose-dependent effect on the proliferation， osteogenic differentiation， mineralization and gene expression of MC3T3-E1 in the range from 1×10-7 to 1×10-5 mol・L-1. At concentrations above 1×10-4 mol・L-1 isoquercitrin showed cytotoxicity， while 1×10-6 mol・L-1 is the optimal concentration of isoquercitrin to improve the osteoblastic activity. All these results implied that isoquercitrin might be the major composition of traditional chinese medicine C. yunnanense to treat bone fractures.
[Key words] isoquercitrin； MC3T3-E1 cell； proliferation； osteogenic differentiation
doi：10.4268/cjcmm20141934