表面活性剂溶血作用的研究进展

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摘要：表面活性剂在制药、功能食品、日用化学品等领域发挥着非常重要的作用。然而，表面活性剂也有一定的毒性。本文综述了国内外有关表面活性剂溶血作用的相关研究进展，包括各类表面活性剂的溶血作用，溶血方法，溶血机制，抗溶血作用以及如何降低溶血等。

关键词：表面活性剂；生物膜；溶血作用

中图分类号：R962

文献标识码：A

文章编号：1672-979X(2010)03-0125-05

目前表面活性剂作为乳化剂、润湿剂、起泡剂、透膜剂等数十种功能试剂被广泛用于传统工业和高新技术领域。在制药工业中表面活性剂多用作透膜剂Ⅲ，使药物有效成分易于进入细胞内从而提高生物药效率。但表面活性剂具有潜在毒性，某些表面活性剂能使血液内的细胞发生裂解并破坏血管的内皮细胞。因此，允许用于制药生产的表面活性剂种类非常少。当也有将表面活性剂成功地用于某些静脉注射药物的抗凝剂和难溶药物的增溶剂。表面活性剂对人体血液最主要的破坏作用就是使血液细胞溶血并裂解死亡，故通常以其溶血作用的强弱来评价其破坏性。另外，由于红细胞易得并含有大量信息，其发生溶血时的现象最易表征和描述，因此，表面活性剂溶血性的研究主要通过观察红细胞的溶血现象来表征。

1　各类表面活性剂的溶血

迄今溶血性研究主要集中在离子型和非离子型表面活性剂，对于两性表面活性剂和其他类型的表面活性剂研究较少。阳离子型表面活性剂毒性较大，有非常强的杀菌能力和溶血性，通常用于制备农药和杀虫剂。非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂毒性相对较小，性能较温和，适用于制药工业。

1.1　非离子表面活性剂

非离子表面活性剂的研究主要集中在聚氧乙烯类(POE)和烷基糖苷类。Ohnishi等在0.1％～0.5％(w/v)浓度范围内研究了POE。研究表明，直链POE最易诱导红细胞溶血；含有支链且脂溶性较低的POE不易诱导溶血，只是使红细胞由球形变成棘状；溶血性随着POE相对分子质量增大而降低。因此认为，含有支链并同时具有较高相对分子质量的非离子表面活性剂更适合做静脉注射药物的透膜剂。常用的POE的溶血性见表1。

Prete等研究了含8个氧乙烯基团的不同烷基链长的POE(C10E8，C12E8，C14Es8，C16E8，C18E8)在等渗缓冲液中的溶血性。结果表明，等渗条件下，表面活性剂的亲水亲油平衡值(HLB值)是衡量溶血性的重要参数，溶血性随着HLB值的减小而增大；随着POE与红细胞膜结合常数的增大而增大；5种POE的溶血顺序是C10E8＜C12E8＜C14E8＜C16E8＞C18E8。比较C10E8、C12E8与TX-100的溶血性，表明短链的POE有较高的溶血性。

研究聚氧乙烯壬基苯酚(poly[oxyethylene(n)nonylphcnol]，P-CmEn)的溶血性，n=9.5的P-C9E9对红细胞的作用呈现两阶段性，表面活性剂低浓度的低渗溶液中，P-C9E9表现出保护红细胞不被溶血的性能；高浓度时，无论低渗溶液还是等渗溶液P-C9E9都表现出溶血性；P-C9E20则不表现溶血性；P-C9E100在浓度大于2×10-4mol/L的低渗溶液中表现出强烈的保护细胞不被溶血的性能，但是，等渗溶液中P-C9E20和P-C9E100都不表现溶血性；P-C9E20和P-C9E100在细胞膜外形成胶束，P-C9E9则与细胞膜形成混合胶束，表明P-C9E20和P-C9E100的单体自身结合成胶束的倾向大于它与生物膜形成混合胶束的倾向，而P-C9E9正好相反。所以，导致了P-C9E20和P-C9E100低溶血和P-C9E100高溶血。

研究聚氧乙烯失水山梨酸醇脂肪酸脂类表面活性剂(Tween20，Tween40，Tween60，Tween80)的溶血性能Ⅲ表明，为避免溶血，将其用于制备药物时必须在其临界胶束浓度下；由于溶血性能Tween20＞Tween40＞Tween60＞Tween80，因此Tween80是首选。在实验中发现表面活性剂有两种作用，一是增加细胞膜的渗透性，二是使细胞溶解。溶血只发生在特定的表面活性剂浓度范围内，低浓度时只提高生物膜对较小分子的渗透性。表面活性剂浓度达到一定范围时，细胞膜的分子结构被破坏，较大的分子可以透过细胞膜，使细胞发生胶体渗透膨胀最终破裂。

对烷基糖苷(APG)类表面活性剂溶血性能的研究发现，由脂肪和糖苷缩合而成的糖苷物较POE对生物膜有更高的吸附和渗透能力。这种相互作用导致生物膜的增溶和渗透性改变，并导致血红蛋白释出。

1.2　阴离子表面活性剂

对于阴离子表面活性剂溶血作用的研究主要集中在赖氨酸类和赖氨酸衍生物类，其低毒性和环境友好性受到特别的关注。

Sanchez等研究了赖氨酸衍生物类表面活性剂的溶血性能。研究表明，所有的赖氨酸衍生物类表面活性剂的溶血性都要低于商业用表面活性剂，因此视觉刺激性小；并且未发现光毒性。与含较小反离子的表面活性剂相比，含较大反离子表面活性剂的溶血性较低，并且对皮肤和视觉的毒性都很小。

Vives等研究了一系列新合成的赖氨酸衍生物类表面活性剂：赖氨酸(77KK)，三羟甲基氨基甲烷(77KT)、赖氨酸钠盐(77KS)、赖氨酸锂盐(77KL)的溶血活性，证明细胞膜表面被表面活性剂饱和吸附时才

会发生溶血，也就是说溶血发生在表面活性剂的CMC附近。如图1所示，与非离子表面活性剂中的P-C9E9相同，77KK和77KT的溶血也呈现两阶段性：低浓度时溶血随着表面活性剂浓度的增大而减小；高浓度时随着表面活性剂浓度的增大而增大(溶血性用H％表示)。77KS和77KL则没有表现出两阶段性，它们的溶血性与浓度呈正比。

2　溶血试验

2.1　红细胞悬浮液的制备

研究生物膜与表面活性剂相互作用时，选取红细胞、红细胞影、脂质体等样品和模型。红细胞由于以下特性而被广泛应用：(1)能直接反映注射药物对细胞生物膜的溶血性；(2)易获取；(3)红细胞的细胞膜与其他细胞的细胞膜性质相近。将采集到的新鲜血液放入盛有抗凝剂的试管中离心分离，然后用缓冲液(pH 7.0～7.4)洗去血浆和白细胞层，剩余的即为红细胞，然后用缓冲液将其配置成一定细胞比容的红细胞悬浮液。

2.2　溶血方法和溶血分析

1968年Kondo等所描述的溶血方法被广泛应用：红细胞悬浮液与等体积不同浓度的表面活性剂恒温混合培养，培养时间和温度可以根据具体情况选择。将培养后的混合物离心分离，用分光光度计测定上层悬浮液吸光度，测定红细胞100％溶血和红细胞在缓冲液中自发溶血的2组吸光度值，其溶血百分数(Hemolysis％)即可直观地反映表面活性剂对红细胞的溶血作用。

3　溶血机制

表面活性剂在达到特定浓度时会诱导溶血，这基于其两亲性质。尽管我们还不是非常清楚溶血在分子水平上的溶血进程和机制，但溶血进程大致分为5步：(1)表面活性剂在细胞表面吸附；(2)表面活性剂插入细胞膜中：(3)引起细胞膜上的物质重排；(4)细胞膜渗透性增大；(5)红细胞破裂。目前，表面活性剂对细胞膜的溶血机制主要有以下3种解释。

3.1　细胞膜穿孔导致溶血

细胞膜存在一定的延展性和最大应力，表面活性剂会明显减弱细胞膜的延展性和所能承受的最大应力。(1)表面活性剂插入细胞膜时并不完全贯穿于磷脂双分子层中，大多数分子只嵌入磷脂双分子层的外层，使其得到比内层更大的扩展，从而大大降低膜的延展性；(2)表面活性剂插入细胞膜时，非极性头插入双分子层中，极性头处于磷脂和水的界面上。极性头之间的静电排斥使膜能承受的最大应力大大减小。当超出最大应力时细胞膜上会出现瞬间的小洞，随着表面活性剂浓度增大变成稳定的小洞，进而导致细胞渗漏和溶血，图2是表面活性剂导致细胞膜上小洞形成的照片。

3.2　细胞膜溶解导致溶血

表面活性剂浓度足够高时，细胞膜发生溶解。表面活性剂分子在细胞膜上与磷脂双分子层形成混合胶束，高浓度时表面活性剂在细胞膜上达到饱和，此时混合胶束逃离细胞膜的同时带走了细胞膜上的磷脂和蛋白质，使细胞膜逐渐溶解并导致溶血，具体过程见图3。

3.3　细胞发生胶体渗透膨胀导致溶血

表面活性剂浓度相对低时，其与细胞膜上的磷脂双分子层形成的混合胶束引起细胞膜重排和结构改变，改变了细胞膜的渗透性，使膜内外的离子能自由交换。跨膜运输的离子浓度梯度虽然消失，但由于细胞内浓度很高且有不可扩散的高分子，使水能够进入细胞内。细胞吸水膨胀导致溶血。

4　抗溶血和降溶血

4.1　抗溶血

某些表面活性剂表现出两阶段溶血性，低浓度下随着表面活性剂浓度增大溶血性减小，此现象称作表面活性剂的抗溶血性。Vinardell研究了新合成的赖氨酸衍生物类表面活性剂表明，77KK和77KT在低渗的小鼠红细胞溶液中都表现出抗溶血性；77KT在人的低渗红细胞悬浮液中也表现出抗溶血性。

很多表面活性剂抗溶血，但具体机制尚不明确，对这一现象最主要的解释主要有两种：(1)表面活性剂两亲分子插入细胞膜后，增大了细胞膜的表面积与体积比，使细胞在破裂前达到一个更大的体积，进而表现出抗溶血性；(2)表面活性剂的反离子与生物膜上的特殊位点相结合导致表面活性剂的两亲分子很难吸附在生物膜上，使细胞不能发生溶血，进而产生了抗溶血作用。超过一定时间后细胞膜上发生重排，表面活性剂的两亲分子可以插入细胞膜上导致溶血。

在所涉及到的新合成的赖氨酸衍生物类表面活性剂中，有的表现出了抗溶血，有的没有表现。因此，抗溶血是一个非常复杂的进程，它不仅与表面活性剂的两亲结构(包括反离子)有关，并且受细胞膜结构组成的影响。

据报道，卵磷脂能降低表面活性剂的溶血作用。Gould等研究表明，在非离子表面活性剂油基聚氧乙烯醚(Brij96，Brij76，Brij56)，阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)，阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)以及两性表面活性剂(溶血卵磷脂)中加入卵磷脂时，其溶血作用都有所降低，并且随着卵磷脂与表面活性剂的摩尔比率(R)增大，溶血百分数降低幅度增大。如图4所示。

5　结语

尽管人们对表面活性剂的溶血机制作了种种假设和讨论，但迄今在分子层面仍无定论。因此，弄清真正的溶血机制仍是亟待解决的问题。

制药工业离不开表面活性剂，如何在利用表面活性剂提高生物药效率的同时，减小甚至避免其溶血作用，将越来越受关注。在弄清表面活性剂的溶血机制之前，如何利用好表面活性剂的抗溶血性，如何通过加入其它物质降低其溶血性也是有实际意义的。