类泛素蛋白FAT10在肝癌中的表达及生物学作用

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[摘要]目的 探讨类泛素蛋白fat10在肝癌细胞中的异常表达和功能活化及其分子机制。方法 将38例肝癌大鼠随机分为空白组、pcDNA3.1-FAT10组、FAT10 siRNA组。采用RT-PCR法检测肝癌及癌旁组织中FAT10 mRNA的表达水平，电穿孔法分别将FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染人肝癌SMMC-7721后，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化，RT-PCR检测PI3K/Akt通路的变化。结果 FAT10 mRNA在大鼠肝癌组织中的相对表达水平明显高于癌旁组织（P

[关键词]肝癌；FAT10；电转法；PI3K/Akt信号通路；凋亡

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）09（a）-0016-03

肝癌因其存活率低，发病率高，已成为众多学者关注的对象[1-3]。类泛素是与泛素具有相似功能的蛋白，在结构上与泛素具有部分相同序列。FAT10是一种新发现的，可以通过共价结合发挥泛素样作用的类泛素蛋白[4-6]。其在多种癌细胞如胃肠癌、肝癌等细胞中得以表达[7-10]。因此，本实验先对肝癌及癌旁组织的FAT10进行检测，后将FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染肝癌细胞，采用多种方法分别检测细胞周期和细胞凋亡的变化，RT-PCR检测PI3K/Akt通路的变化，旨在为肝癌的治疗提供新的手段。

1资料与方法

1.1一般资料

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：2014年9月～2015年12月在沈阳医学院实验室完成。

材料及来源：SMMC-7721细胞株购于上海誉贸实业有限公司，由本实验室保存。L-DMEM培养基、胎牛血清和混合抗生素购自GIBCO公司，FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10均由上海吉玛公司合成，电穿孔仪，TRIzol Reagent购自Invitrogen公司，CCK-8试剂盒购于上海Dojind化学科技有限公司，流式细胞仪购于赛默飞公司，多克隆兔抗体Akt购于Proteintech公司，GAPDH抗体购于Bioworld公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自优维宁生物技术公司。

1.2 RT-PCR检测FAT10表达

38例肝癌大鼠开腹，取少量肝癌及癌旁组织粉碎后，加入含1 mg/ml亚铁离子的PBS多次反复冲洗，用匀浆器打匀，并过100 mm滤膜，备用。吸取2 μl的悬浮细胞液，正反向引物各加入1 μl悬浮细胞液。反应循环条件如下：95℃变性5 min，95℃退火30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，45循环，最终72℃延伸7 min。将PCR产物10 μl于1.2%琼脂糖凝胶电泳30 min，采用凝胶自动成像及分析系统，电泳结果用凝胶图像分析系统分析电泳条带光密度值，计算光密度与GAPDH的光比值。

1.3流式细胞术检测细胞周期和凋亡

未经任何处理的肝癌细胞为空白组。转染FAT10 siRNA（FAT10 siRNA组）和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10（pcDNA3.1-FAT10组）48 h后，收集各组细胞，37℃下，0.25%胰酶消化，1500 r/min，离心10 min，去上清，PBS洗涤3次，重悬细胞浓度为1×106/ml。移液枪取100 μl的细胞于流式管中，缓慢加入70%的乙醇溶液，同时用移液枪移取100 μl的细胞于另一组流式管中，缓慢加AnnexinV-FITC溶液，两组流式管4℃下充分振荡，并静置24 h，1000 r/min离心10 min后，除去细胞固定液，PBS溶液洗涤多次，加入100 μl，200 μg/ml的RNA酶溶液，室温静置1 h，加入50 μg/ml的PI液染色，0.5 h后流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。

1.4 RT-PCR检测PI3K/Akt信号通路

按TRIzol Reagent说明书提取各组细胞总RNA，以总RNA mRNA为模板，反转录合成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。正反向引物各加入1 μl悬浮细胞液FAT10的上游为：5′-AATACCTGGTGTCGGTCTCA-3′，下游为：5′-TCGAGCTCATCCTAATGGAG-3′，扩增目的基因片段长度为210 bp。内参GAPDH的上游为：5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游为：5′-AGGAGTGGGTGTCGCTG-3′，目的基因扩增长度为350 bp。反应条件：95℃变性5 min，95℃退火30 s，61.5℃ 30 s，72℃ 30 s，30循环，72℃延伸10 min。将PCR产物10 μl于1.2%琼脂糖凝胶电泳30 min，结果用凝胶图像分析系统分析，计算光密度与GAPDH的光比值。

1.5统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计量数据以平均数±标准差表示，采用t检验，多组间的数据比较采用方差分析，以P

2结果

2.1 FAT10在肝癌及癌旁组织中的表达

肝癌组织中FAT10的表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P

2.2细胞周期及凋亡

沉默FAT10表达，FAT10 siRNA组细胞周期无明显变化，细胞凋亡率明显升高。促进FAT10基因表达，细胞周期无明显改变，细胞凋亡率降低，但仍高于基因沉默癌细胞FAT10表达后的细胞凋亡率，各组比较差异有统计学意义（P

表1 各组细胞周期分布及细胞凋亡情况比较（x±s ）

与FAT10 siRNA组比较，*P

2.3 Hsp90/Akt信号通路变化

沉默癌细胞FAT10表达后，PI3K/Akt mRNA信号通路与未转染的SMMC-7721相比表达下调，促进FAT10细胞表达，PI3K/Akt mRNA信号表达最高，重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染的SMMC-7721细胞PI3K/Akt mRNA信号表达介于两者之间，各组比较差异有统计学意义（P

3讨论

类泛素蛋白对肝癌的转化、增殖和化疗敏感性有很强的调节作用[11-14]。PI3K/AKT的信号调节对细胞自噬具有抑制作用，体内特定因子结合相应受体，激活PI3K，促进AKT的磷酸化，降低GTP酶活性，对自噬负向调节[15]。

本研究首先检测了肝癌及癌旁组织的FAT10 mRNA水平，结果显示，肝癌组织中的FAT10 mRNA表达远高于癌旁组织，可见FAT10与癌症的形成有关。进一步研究发现，转染了FAT10 siRNA的SMMC-7721增殖活性显著降低，远低于基因促进FAT10表达后的肝癌细胞增殖活性，推测FAT10在肝癌细胞异常增殖中发挥作用。研究发现，FAT10的沉默或促进表达对细胞周期影响甚微，对细胞凋亡率及侵袭能力起关键作用。FAT10沉默后，细胞凋亡率和侵袭能力明显低于FAT10促进表达的细胞凋亡，可见FAT10是通过影响细胞凋亡发挥作用的。对于其机制的探索，本实验采用RT-PCR检测PI3K/Akt信号通路的变化，PI3K/Akt信号通路表达下降，可见自噬得到促进，起到抑制癌细胞作用，而在基因促进癌细胞的PI3K/Akt信号通路，表达明显上调，抑制细胞自噬现象，癌细胞得以扩增。

本研究结果显示，抑制FAT10基因，肝癌细胞增殖、凋亡等方面都会得到抑制，FAT10的作用机制与PI3K/Akt信号通路表达相关，FAT10可促进PI3K/Akt信号通路的表达。

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（收稿日期：2016-05-07 本文编辑：王红双）