细胞培养法淋巴细胞微核标本的制作过程及注意事项
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【摘要】 目的 提高淋巴细胞微核标本的制作及阅片质量。方法 对接触放射性工作的岗前、在岗及离岗人员抽静脉血接种于1640培养基进行培养、收获、制片、染色、阅片。结果 按照平时积累的经验操作可提高制片及阅片质量。结论 注意操作中的细节问题可提高制片及阅片质量。
【关键词】 淋巴细胞微核； 标本制作； 健康监护； 放射
淋巴细胞微核测定是细胞遗传学方法之一，对淋巴细胞微核率的观察，不仅能早期发现辐射效应，而且还能对受照个体进行生物剂量估算，是《职业健康监护管理办法》中接触放射性工作人员进行健康监护中的必检项目之一［1］，是评价放射工作者所受辐射损伤的一项非常有意义的指标。为了提高微核的检出率和阅片效率，应严格按照操作规程进行实验操作。笔者所在实验室是北京市能够承担放射性危害因素职业健康监护工作为数不多的几家单位之一，现将工作中总结的一些具体的操作方法和注意事项报道如下。
1 资料与方法
1.1 样本来源 接触放射性工作的岗前、在岗及离岗人员。
1.2 方法
1.2.1 接种 消毒1640培养基，抽静脉血接种于1640培养基内混匀，浓度要适当（血量：25～30滴）。瓶上写清楚受检者姓名或者实验室自行编号。
1.2.2 培养 接种后将培养基放于（37±0.5） ℃恒温培养箱内培养72 h。
1.3 收获
1.3.1 收集细胞 将细胞悬液混匀倒入编好号的洁净离心管中，1500 rpm离心5 min，弃上清液。
1.3.2 低渗 加入0.075 mol/L氯化钾低渗夜5 ml，用滴管轻打混匀，低渗10 min。
1.3.3 预固定 加入1 ml固定液，轻轻混匀后1500 rpm离心5 min。固定液为甲醇:冰醋酸（3∶1）。
1.3.4 固定 弃上清液，加入5 ml固定液，轻轻混匀，静置10 min，1500 rpm离心5 min，弃上清液。重复操作固定步骤2～3次，直至固定液透明为止。
1.3.5 制悬液 弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液打匀。
1.3.6 滴片 吸取细胞悬液滴在一张洁净的4 ℃湿的载玻片上，轻吹散，风干，及时正确编号。
1.3.7 染色 Giemsa染液染色20 min左右，细水冲洗多余染液，风干。
1.3.8 镜检 光学显微镜下计数1000个胞体完整、已转化的淋巴细胞，计数淋巴细胞微核，以千分率（‰）表示。
1.3.9 微核判定标准 微核应位于完整的淋巴细胞胞浆内，与主核完全分开（如有重叠或相切，必须看到各自的完整核膜），呈圆形或椭圆形，结构与主核相同，着色与主核一致或略浅，不折光，大小为主核的1/3以下的小核［2］。
1.4 好片的评价标准 细胞数量多、分布均匀、密度适中、染色清晰、核浆分明、透明度好。
2 注意事项
2.1 要严格进行消毒，避免细胞在培养过程中细菌污染，影响制片效果及阅片。
2.2 接种血液量要适当，太多不容易打散，太少不易观察。以5 ml注射器接种约25～30滴为宜。
2.3 培养温度应严格控制在（37±0.5）℃。
2.4 低渗的目的是使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀。低渗过度，淋巴细胞也会破裂；低渗不足则胞浆厚，可能使微核漏检。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗处理浓度及时间要适当，且低渗后混匀细胞时一定要轻，否则会引起膜破裂。
2.5 离心速度过高或时间过长，细胞团不易打散或细胞破碎；反之，细胞易丢失。
2.6 固定液应在使用前新配制。微核制备操作过程中最关键的步骤是低渗处理，根据接种血液量多少决定加低渗液量的多少，将培养物全部转入洁净离心管后，应尽快加入固定液进行预固定。
3 讨论
淋巴细胞微核是细胞的染色体发生断裂之后，细胞进入下一次分裂时，染色体片段不能随着有丝分裂进入子细胞，而在胞浆中形成直径小于主核1/3的碎片，它可以是整条染色体，也可以是染色体片段，嗜色性和主核一致，完全与主核分开的圆形或椭圆形的微小核。各种理化因素作用于细胞染色体，影响其正常的功能，使细胞的DNA复制和染色体分裂受到破坏，纺锤体的功能受到影响产生微核，是染色体畸变间期表现出的一种损伤类型。微核率可以反映致畸因素对细胞的损伤程度和染色体稳定性［3］。淋巴细胞微核测定是放射工作人员职业健康检查的特殊检查项目，是最直接反映辐射损伤的检查项目之一。随着核科学的快速发展，放射工作人员逐渐增加以及职业病防治法的颁布实施，职业健康检查日益受到重视，参加职业健康检查的放射工作人员逐年增多。淋巴细胞微核测定的特点是：测定对象为活的细胞，全部为手工操作、环节多、时间长，易受各种因素的影响而导致结果的偏离。这就要求必须做好每一步工作，才能制备出良好的淋巴细胞微核片，提高淋巴细胞微核检出率和阅片效率，及时准确反映辐射损伤情况。
淋巴细胞微核标本的制作每一步都非常关键，出现失误就会导致片子质量出现问题，影响检查结果。实验人员应严格按照操作规程进行实验操作，以确保微核标本片的制备质量，提高微核检出率和阅片效率，及时准确反映辐射损伤情况，对辐射防护作出正确评价，对放射工作人员的健康进行监护，对意外照射、突发事件估算剂量，为放射患者诊断和治疗提供可靠依据。
参 考 文 献
［1］ 北京市卫生局.《职业健康监护管理办法》附件1［R］.职业卫生文件汇编（一），2000:47-48.
［2］ WS/T187-1999.淋巴细胞微核估算受照剂量方法［M］.北京:中国标准出版社,1999:146.
［3］ 李冬盎,官瑞霞.淋巴细胞微核在国内职业病防治中的应用［J］.现状实用医药杂志,2006,12(23):1512.
（收稿日期：2011-10-23）