肺癌组织和肿瘤细胞系中BRG1的表达分析
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇肺癌组织和肿瘤细胞系中BRG1的表达分析范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘 要：BRGJ(brahma-related gene 1)是进化上高度保守的SWI／SNF染色质重塑复合物的成员之一，研究表明：BRGI具有抑瘤基因的特征，可能与肿瘤的发生发展有关,我们采用RT―PCR、NortherR杂交和Westemblotting证实：肺腺癌细胞系A549和鼻咽癌细胞系HNE2、HNE3、CNE1中无BRG1的表达，而肺鳞癌细胞系NCI―H520、永生化正常人支气管上皮细胞系HBE和鼻咽癌细胞系HONE1、HNE1、CNE2中有BRGJ的表达，同时，通过RT―PCR检测10例肺癌组织标本，发现60％(6/10)的肺癌组织中日BRG1的mRNA水平明显下调，而配对正常肺组织中BRG1，的mRNA表达未见改变,对29例肺癌组织和10例配对正常肺组织切片进行免疫组化染色，结果显示：肺癌组织中BRG1蛋白表达的阳性率为37.9％(11/29)，配对正常肺组织中BRG1蛋白表达的阳性率为90％(9/10)，两者的差异有显著性(P
中图分类号：R730
文献标识码：A
文章编号：1007―7847(2007)0l-0084―06
肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类的健康和生命,近年来我国肺癌的发病率和死亡率迅速上升，有人预计中国将成为21世纪的肺癌大国，肺癌一般分为4种主要的组织学类型：鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌，前三者统称为非小细胞肺癌(NSCLC)，约占肺癌总数的75％，后者称小细胞肺癌(SCLC)，约占25％，肺癌的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，其中瘤基因和抑瘤基因发挥着至关重要的作用，已有研究显示，肺癌在临床前期就有大约10个分子事件，包括瘤基因myc、K-ras、EGFR、Her-2/neu、Bcl-2的激活与抑瘤基因p53、Rb、FHIT、p16的失活等，但这些基因在多种肿瘤中都普遍存在改变，还不足以完全解释肺癌发生发展的机制，因此有必要继续寻找和鉴定新的肺癌相关基因。
Girard等利用399个微卫星标记对肺癌细胞系及组织标本进行全基因组等位基因分析(allelotyping)，发现NSCLC中19p13区域存在高频率的杂合性丢失(LOH)，已知定位于19p13.3的抑瘤基因LKB1/STK11，在约30％-50％有19p LOH的肺腺癌中失活，但定位于该区域的其他基因仍可能是肺癌的候选抑瘤基因，因为LKB1/STK11的突变目前只发现于肺腺癌中，而占NSCLC大多数的鳞癌中并未检测到LKB1/STK11的突变。
BRGl是1993年Khavari等利用果蝇的Brm(Brahma)DN段为探针，筛选Hela细胞cDNA文库而分离得到的一个人类基因，属于进化上高度保守的SWI/SNF染色质重塑复合物的成员之一，它由35个外显子和34个内含子组成，其转录本的大小约为5kh.brg1蛋白由1613个氨基酸组成，共有4个结构域：I脯氨酸富集区、Ⅱ电荷富集区、Ⅲ依赖DNA的ATP酶区、IV溴化区，其相对分子质量为205kD，是一种磷酸化白，主要以ATP依赖的方式通过破坏组氨酸一DNA的接触而调节基因的表达，通过放射杂交图谱分析，已将BRGl定位于19p13，
大量研究表明：将BRGl重新导入到其缺陷的肿瘤细胞系中，可阻滞细胞生长并逆转细胞的转化表型；BRGl及SWI/SNF复合物的其他成员，能与Rb1、p53、BRCA1、LKB1/STK11等抑瘤基因产物相互作用，参与细胞生长和分化的调节，另外，转基因动物实验也证实：BRGl纯合子突变(Brgl-/-)小鼠因不能发育而致死；BRGl杂合子突变(Brgl+/-)小鼠虽发育正常，但较BRGl野生型(Brgl+/+)小鼠容易发生肿瘤，这说明BRGl具有抑瘤基因的特征，可能与肿瘤的发生发展有关。
目前，国外关于肺癌中BRGl的研究较少，国内则未见报道，从已有的研究得知：BRG1蛋白在至少10％-30％的NSCLC组织和细胞系中表达下调或缺失，且这些BRGI蛋白表达缺失的NSCLC病例预后较差，但BRG1在我国肺癌患者中的表达情况及其mRNA和蛋白质表达的相关性仍不清楚，为此，我们从mRNA和蛋白质两个水平对肺癌组织和细胞系进行BRG1表达分析，旨在阐明BRG1表达与肺癌发病的关系。
1 材料与方法
1.1 细胞、组织与质粒
永生化人支气管上皮细胞系HBE，肺鳞癌细胞系NCI.H520，肺腺癌细胞系A549，鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、HNE3、HONE1，大肠腺癌细胞系SW480、HT-29，宫颈癌细胞系HeLa，喉癌细胞系HEp-2，肾癌细胞系RLC和肝癌细胞系SMMC由本室提供，10例原发性肺癌组织标本，取自中南大学湘雅二医院经病理确诊且未经放疗和化疗的患者，其中肺鳞癌7例、腺癌2例、小细胞癌1例，29例肺癌及10例配对正常肺组织石蜡块取自湘雅医院病理科，包括肺鳞癌17例、腺癌5例、小细胞癌5例和腺鳞癌2例，质粒pBJ 5－BRGl由美国斯坦福大学Crabtree博士惠赠．
1.2 主要试剂
Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程公司)，限制性内切酶BamH I、Msp I、HpaⅡ(MBI公司)，逆转录试剂盒(Promega公司)，蛋白酶K、SDS(Sigma公司)，小牛血清、RPMI1640培基、TRIzol试剂、鲑精DNA、低熔点琼脂糖(Invitrogen公司)，BCA蛋白质浓度测定试剂盒(PIERCE公司)，羊抗人BRGl抗体(Santa Cruze公司)，辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗、ECL Western blotting检测试剂盒(Amersham Pharmacia公司)，dCTP(北京亚辉公司)，胰酶、λDNA/HindⅢ和PCR marker、琼脂糖(华美生物工程公司)，PCR引物用Primer3软件设计，由上海生工生物工程公司合成，PCR引物序列和产物大小见表1。
1.3 方法
1.3.1 RNA抽提及Northern杂交
细胞／组织RNA按TRIzol试剂操作程序提取。RNA电泳以及Northern杂交均参照文献[14]的方法，探针标记则按试剂盒说明书进行，
1.3.2 RT-PCR
cDNA合成：取1μg RNA样品，加1μLoligodT(0.5g/L)，65℃变性10min，冰上骤冷后加10×逆转录缓冲液2μL，25mmol/L MgCl
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文
μL，10mmol/LdNTPs 2μL，RNasinO.5μL(40U/μL)，RNase-free水补至总体积20μL，42℃反应60min，95℃灭活5min，冰上骤冷，置-20℃冰箱保存。
PCR扩增：取逆转录产物2μL，置O.5 mLEppendorf管中，分别加入10×PCR缓冲液2μL，2mmol/L dNTPs 2μL，内对照上、下游引物各0.25μL(浓度12.5mmol/L)，BRGl cDNA上、下游引物各0.75IxL(浓度12.5mmol/L)，Taq酶lU。加亚沸水至终体积20μL，20μL石蜡油覆盖，95℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃再延伸5min，产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.3 Western印迹
蛋白质抽提：培养细胞用D－Hanks液洗涤两遍，加裂解液(2％SDS，62.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/Lβ－巯基乙醇)50-100μL；振荡混匀，冰上裂解30min；4℃ 12000r/min离心20min，吸取上清至新Eppendoff离心管中；吸少量用BCA法测定蛋白质浓度，其余加等体积2×Loading buffer(l35mmol/L Tris―HCl pH6.8，20％甘油，0.02％溴酚蓝，6％SDS，10％β-巯基乙醇)沸水浴中加热5min，-70℃保存待用．
Western blotting：每种细胞样品取100μg蛋白质于8％SDS聚丙烯酰胺凝胶120V电泳2.5h；然后100V电转移1h，使经分离的蛋白质转移至硝酸纤维素(NC)滤膜，用PBS溶解的5％脱脂牛奶室温封闭2h；羊抗人BRGl抗体1:100稀释于5％脱脂牛奶中，与滤膜在室温下于平缓摇动的摇床平台上温育1h；PBS洗膜3×15min，辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗l：2500稀释于5％脱脂牛奶中，与滤膜在室温下于平缓摇动的摇床平台上温育1h；PBS洗膜3×15min，保鲜膜上配制ECL检测试剂(化学发光作用底物)，与滤膜作用3-5min；暗盒中曝光3min，取出X光片显影、定影，取出滤膜，用丽春红染色，显示Loading对照．
1.3.4免疫组化S-P法和结果判断及统计学分析
S-P法：石蜡切片常规脱蜡(二甲苯10 min×2次无水乙醇5min×2次)3％H2O2阻断内源性过氧化物酶30min95％酒精5min85％酒精5min自来水冲洗双蒸水洗5min×2次10mmol/L EDTA液中高火档微波修复抗原5rain×2次I×PBS洗3min×2次滴加封闭血清37℃30min滴加一抗(BRGl抗体浓度为1：501 37℃30 min后置4℃孵育过夜PBS洗3min×3次滴加二抗37℃30minPBS洗3min×3次滴加Streptadvidin-Peroxidase 37℃30minPBS洗3 min×3次DAB显色1－2min自来水冲洗苏木素复染脱水封片光镜观察，阴性对照，用PBS液代替一抗，其余步骤同实验组，阳性对照，用Hela细胞涂片做免疫组化。
判断标准：BRGl蛋白主要表达于细胞核，因此阳性染色为棕黄色颗粒定位于细胞核内，光镜下随机观察5个高倍视野共计500个细胞中的染色阳性细胞百分数，阳性细胞数15％为BRGI表达阳性(+)；阳性细胞数>50％为BRGI表达强阳性(++)。
统计学分析：运用SPSS软件包进行秩和检验。
2 实验结果
2.1 RT-PCR检测肺癌组织和肿瘤细胞系中BRGl的mRNA表达
以β-actin为内对照，应用RT-PCR方法检测了15株肿瘤细胞系和10例肺癌组织中BRG1的mRNA表达．结果如图1所示，BRGl在53.3％(8/15)被检测的肿瘤细胞系中mRNA表达下调或缺失；10例肺癌组织中有6例BRGl的mRNA表达下调或缺失，而10例配对正常肺组织中均有BRGl的mRNA表达。
2.2 Northern杂交分析肿瘤细胞系中BRGl的转录情况
以GAPDH作为内对照，用Northern杂交证实BRG1在肺癌和鼻咽癌细胞系中的转录情况，结果如图2所示，在A549、CNEI、HNE2和HNE3等4株细胞系中检测不到BRGl的转录，而在另外4株细胞系即NCI-H520、CNE2、HNE1和HONE1中能检测到BRG1的转录本，大小约5kb。
2.3 Western Blotting检测肿瘤细胞系中BRGl蛋白的表达
以Hela细胞为阳性对照，进一步用WesternBlotting检测肺癌和鼻咽癌细胞系中BRGl蛋白的表达情况．从图3可见，A549、CNE1、HNE2和HNE3细胞中无BRGl蛋白表达信号，而HNE1、HONE1、CNE2和NC1-H520细胞中可检测到BRGl蛋白的表达。
2.4 免疫组化分析BRGI蛋白在肺癌及配对正常肺组织中的表达
结果显示：BRGI蛋白在配对正常肺组织中有较强表达，细胞核多呈棕褐色(见图4A)，而BRGI蛋白在肺癌组织中表达程度明显降低，细胞核多呈淡黄色或不着色(见图4B)，
对BRGI蛋白在肺癌和配对正常肺组织中的表达水平进行统计分析(见表2)，利用SPSS软件，采用秩和检验，结果显示：BRGI蛋白在肺癌组织中的表达水平明显低于配对正常肺组织，Z=-2.594。P=0.016(P＜0.05)，差异具有显著性意义．
3 讨论
肺癌在染色体19p13区域存在高频率的LOH，通过放射杂交图谱分析，BRGl已定位于19p13，根据Knudson的“二次打击”学说，高频率、非随机的染色体LOH往往暗示该缺失区域中可能含有抑瘤基因，因而推测BRG1作为候选的抑瘤基因与肺癌的发生发展相关，另一方面，BRGl作为进化上高度保守的SWI/SNF染色质重塑复合物的成员之一，在哺乳动物细胞中可通过与Rb1、p53、BRCA1、LKB1/STK1，等抑瘤基因产物相互作用，参与细胞生长和分化的调节，同时，细胞转染和转基因动物实验也证实BRGl具有抑癌基因的特征，
但迄今国外关于肺癌中BRGI的研究还较少，国内则未见报道，从已有的研究得知：BRGl蛋白在至少10％-30％的NSCLC组织和细胞系中表达下调或缺失，且这些BRGl蛋白表达缺失的NSCLC病例预后较差，不过这些资料均来自美国肺癌病人标本的研究，而BRGl在我国肺癌患者中的表达情况及其mRNA和蛋白质表达的相关性目前仍不清楚。
我们通过RT-PCR和Northern杂交，检测到在60％(6/10例)的肺癌组织及肺腺癌细胞系A549等多种肿瘤细胞系中BRG，的mRNA表达下调或缺失．采用Western blotting方法则进一步证实，在BRGl转录下调的肿瘤细胞系中BRGl蛋白质的表达也下调或缺失，两者间为正相关，对29例肺癌组织及10例配对正常肺组织标本进行免疫组化检测，结果显示BRG1蛋白在肺癌组织中表达的阳性率为37.9％(11/29例)，在配对正常肺组织中表达的阳性率为90％(9/10例)，经秩和检验分析，两组间BRGl蛋白的表达水平具有显著性差异(P＜O.05)，上述结果表明，BRG1确实在我国肺癌病人组织标本和多种肿瘤细胞系中表达异常，且其mRNA和蛋白质表达呈正相关，BRG1在肺癌中表达改变的原因值得进一步研究，这对于阐明BRG1在肺癌发病中的作用具有重要意义。
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文