姜黄素对动脉粥样硬化家兔内皮祖细胞的影响
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[摘 要] 目的 观察姜黄素对动脉粥样硬化（AS）家兔血浆非对称性二甲基精氨酸（ADMA）及骨髓血内皮祖细胞（EPCs）的影响。方法 28只家兔分为3组，即对照组（喂食普通饲料）、模型组（喂食高脂饲料）和姜黄素组（喂食高脂饲料+100mg/kg·d-1姜黄素）。12周后，测定血总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL_C）、ADMA水平，计算主动脉内膜斑块面积，取主动脉弓做病理切片，采用密度梯度离心法分离兔骨髓血单个核细胞（MNCs）。用贴壁法测定EPCs黏附能力，改良Boyden小室法测定EPCs迁移能力及CCK_8法测定EPCs的增殖能力。结果 姜黄素组较模型组内膜斑块面积减少，差异有统计学意义（P
[关键词] 动脉粥样硬化；姜黄素；非对称性二甲基精氨酸；内皮祖细胞
中图分类号：R54 文献标识码：A 文章编号：1009_816X（2013）04_0279_04
姜黄素（curcumin）是从姜黄中提取的一种酸性酚类物质，能减轻家兔动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的病变程度，可能在多个环节上影响动脉粥样硬化的发生和发展[1，2]。非对称性二甲基精氨酸（asymmetricdimethylarginine，ADMA）为一种内源性NO合成抑制剂，SchulzeF等[3]研究认为，其为冠心病（CHD）的一个独立危险因素。内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）是一类能增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。研究表明，EPCs不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。近来随着EPCs促进血管新生、修复损伤血管内膜作用的相继揭示，其在冠心病防治上的作用已经越来越受到重视[4，5]。本研究旨在通过复制AS家兔模型，观察其对ADMA及EPCs的影响，探讨姜黄素可能的抗AS机制。
1 资料与方法
1 材料与方法：
1.1 主要材料：日本大耳白家兔由温州医学院动物实验中心提供（浙医动字：2200300002），在实验中心饲养。胆固醇由上海国光生物有限公司生产；姜黄素由神威药业有限公司生产；NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。ADMA标准品，邻苯二甲醛衍生试剂（OPA），3_巯基丙酸、FITC标记的荆豆凝集素I（FITC_UEA_Ilectin）、人淋巴细胞分离液（Ficoll，密度110773）购于Sigma公司，高效液相色谱仪为Agilent1100系列。另备人纤维连接蛋白（Roche公司生产），血管内皮生长因子（PeproTechEC公司生产），培养基M199、胎牛血清、胰酶（Gbico公司生产），DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI_ac_LDL）（Molecularprobe公司生产），CCK28检测试剂盒（上海同仁化学研究所）
1.2 实验方法：
1.2.1 实验药品：采用高脂饲料即89%基础饲料、10%猪油、1%胆固醇复制AS动物模型。姜黄素为黄色粉末，实验前用0.5%羧甲基纤维素纳（CMC_Na）溶液配成浓度为10g/L的姜黄素/0.5%CMC_Na溶液混悬液（现配现用），供家兔灌胃用。
1.2.2 AS模型复制和分组：28只2～3个月龄健康雄性日本大耳白家兔，体重1.7～2.1kg。给予基础颗粒饲料适应性喂养1周，随机分为3组：正常对照组、模型组和姜黄素组。正常对照组予喂饲正常饲料，动脉粥样硬化模型组和姜黄素组给予高脂饲料喂养，每只家兔每日进食量均为150g，单笼喂养，饮水不限，连续喂养12周。在喂养过程中，正常对照组和模型组予单纯0.5%CMC_Na溶液10ml/kg体重灌胃，姜黄素组予10g/L的姜黄素混悬液按10ml/kg体重灌胃，每日一次（即100mg/kg·d-1姜黄素）。
1.2.3 取材：于高脂喂养第12周末，禁食12h，经耳中央动脉取血备用。20%乌拉坦20mL/kg腹腔注射，沿腹正中线切开，将主动脉从心脏与主动脉连接的位置及髂动脉分支处剪断，离体后纵向剪开主动脉，予10%中尔马林溶液固定，待苏丹IV染色及病理检查。
1.2.4 兔骨髓血EPCs的分离、培养：第12周末双侧胫骨平台穿刺抽取骨髓血，用密度梯度离心法获取单个核细胞，接种于包被有人纤维连接蛋白的24孔培养板中，每孔中加入1ml的M199培养液（含20%胎牛血清、VEGF10μg/L、青霉素1×105U/L、链霉素1×105U/L），置37℃5%CO2饱和湿度培养箱中培养3d后，用Hank液洗掉未贴壁细胞，换培养液继续培养。
1.2.5 血脂和血浆NO检测：取血2ml，标本经3000rpm，离心15min，取血浆，用全自动生化仪检测血脂指标。TC测定用CHOD_PAP法；LDL_C测定用直接法。采用硝酸还原酶法测定血浆NO含量，步骤严格按照说明书操作进行。
1.2.6 ADMA的测定：配置浓度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0mg/L的ADMA标准品溶液系列，经高效液相色谱分析制作标准曲线。取分装冷冻的血浆1ml，加5_磺基水杨酸去蛋白，离心取上清，经预先配置的OPA衍生试剂衍生后，进样，测定血浆ADMA含量。
1.2.7 主动脉内膜脂质斑块的观察：取经10%中尔马林溶液固定12h后的主动脉，水冲10分钟，擦干后放入苏丹IV染液8分钟，斑块部位着色，多媒体彩色病理图文分析系统IMAGINEPRO分别测量斑块面积和主动脉内膜面积，计算斑块面积占内膜面积的百分比。
1.2.8 病理检查：截取0.5cm主动脉弓，石蜡包埋，制作厚5μm切片。HE染色：苏木素、伊红套染常规脱水，树脂封片。
1.2.9 EPCs的双染色试验：在培养的第6天，将细胞与DiI_ac_LDL（2.4mg/L）一起于37℃避光孵育2h，1%多聚甲醛固定10min，PBS冲洗2次，再加入FITC_UEA_1_lectin（10mg/L）继续避光孵育1h。采用多波长激光共聚焦显微镜观察鉴定双染色阳性的细胞。
1.2.10 CD34、FlK_1和Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色：分别滴加一抗CD34（1：100），FLK_1（1：100），Ⅷ因子（1：50）过夜，洗涤后滴加1：100二抗，37℃孵育30min。PBS洗2分钟×3次。DAB显色，滴加苏木精染液染色，水溶性封片剂封片保存。随机选取5个200倍视野，计算阳性率。
1.2.11 体外血管形成实验：冰上操作，将matrigel铺于96孔培养板上（30μl/孔）。置37℃培养箱中孵育1h成胶。消化细胞，并重悬于EGM_2培养液中。调整细胞数为2×108/L。将细胞接种于96孔培养板中（约20000细胞/孔）。置37℃培养箱中，每2h观察血管腔的形成情况。
1.2.12 EPCs迁移能力的检测：0.25%胰酶_EDTA消化贴壁细胞，制成细胞悬液。将100ul培养液加入改良的Boyden小室的下室，同时在上室注入悬浮2×104个EPCs的培养液150ul。培养24h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用甲醇固定，苏木素染色，随机选择5个显微镜视野（×200），计数迁移细胞数。
1.2.13 黏附能力的测定：各组细胞以0.25%胰酶消化后，制成细胞悬液并计数。再将等量EPCs接种到48孔培养板，置37℃培养箱中培养30min，洗去各孔未贴壁细胞，倒置相差显微镜下随机10个视野（×400）计数重贴壁细胞数。
1.2.14 增殖能力的测定：CCK28试剂盒检测细胞增殖能力是二苯基四氮唑溴盐（MTT）法的替代方法。各组细胞以0.25%胰酶消化后，制成细胞悬液，再将等量EPCs接种到96孔培养板，每孔加CCK2810μl，培养4h后，置酶标仪上于450nm处测吸收度A值，参比波长600nm。
1.3 统计学处理：采用SPSS13.0版软件，实验数据计量资料以（x-±s）表示，进行方差齐性F检验，HPLC中运用直线回归分析，建立直线回归方程，P
2 结果
2.3 主动脉病理形态学改变：①肉眼观察：模型组主动脉弹性明显下降，几乎整条主动脉内膜可见梭形乳白色斑块或脂纹，动脉内膜有明显隆起；姜黄素组粥样病变明显减轻，主要位于主动脉弓，胸、腹主动脉斑块少见，动脉内膜隆起程度较对照组轻，且动脉较对照组柔软有弹性。②HE染色光镜观察：模型组内膜增厚，斑块形成，增厚的内膜中含大量泡沫细胞，内膜表面不光滑，内皮细胞缺失或不连续，中膜不规则增厚，平滑肌纤维显著紊乱；姜黄素治疗组可见内膜局限性隆起，内膜增厚但未达管壁全周，内膜下可见散在泡沫细胞，中膜平滑肌纤维排列稍紊乱。
2.4 EPCs的鉴定[6，7]：培养到第6天的贴壁细胞形成了梭形的内皮样细胞。荧光显微镜下观察到贴壁细胞吞噬DiI_ac_LDL（发红光）和FITC_UEA_I（发绿光）；并通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）鉴定DiI_ac_LDL和FITC_UEA_I双染色阳性细胞（呈黄色）被认为是正在分化的EPCs。培养第6天的EPCs的CD34、flk_1和Ⅷ因子表达的免疫组化染色阳性率分别为（83.44±3.65）%、（85.23±2.92）%和（87.98±3.10）%。将培养第6天的EPCs消化后，接种在matrigel凝胶上，细胞拉长变形，长度为宽度的4倍以上认为形成小管状，出现梭形细胞围成的多边形管腔样的典型血管状，见图1。图1 CD34（A）、flk_1（B）和Ⅷ因子（C）表达的免疫组化染色（×200）
2.5 姜黄素对兔外周血EPCs黏附、迁移、增殖能力的影响：模型组家兔外周血EPCs黏附能力较正常对照组降低，差异有统计学意义（P
3 讨论
EPCs是一群能增殖分化为成熟血管内皮细胞，并参与出生后血管新生及内皮损伤修复的前体细胞。内皮损伤是被认为是动脉粥样硬化形成的始动因子。内皮损伤后的修复过程除了相邻成熟内皮细胞延展修复外，还有一部分是通过外周血中的EPCs分化为成熟内皮细胞完成。研究证实[8，9]，冠心病患者循环中的EPCs数量、增殖、迁移功能等都发生了明显的变化，其在冠心病等缺血性疾病的发生、发展中扮演了重要角色。
NO是早期判断血液内皮细胞功能改变的指标之一，对维持血管基础张力有重要作用，近来研究认为内皮型一氧化氮合酶（eNOS）来源的NO在EPCs的动员、分化及功能发挥过程中起了关键的作用[10]。而ADMA是内源性的NOS抑制剂，可以抑制eNOS的活性，减少NO的产生，对心血管疾病的发生、发展有重要的促进作用，其浓度的提高所致内皮功能的不全将增加动脉硬化事件的发生，是CHD发生的独立的危险因素[11]。以往的研究发现，高血压病、动脉粥样硬化性心脏病、高胆固醇血症、糖尿病和慢性肾病等在出现解剖学改变之前，就可导致血管内皮功能紊乱，并发现血清ADMA水平的升高。
姜黄为姜科植物CurcumalongaL.的根茎，是传统的活血化瘀药。而姜黄素是姜黄的主要有效成分之一，有降脂、抗氧化、抗炎、抗感染等作用，在心血管疾病治疗上有着积极的正性作用。我们的研究中发现，模型组血浆ADMA水平显著上升，而姜黄素组血浆ADMA水平与模型组相比显著降低，NO水平刚好相反。而姜黄素组的外周血EPCs黏附、迁移、增殖能力要明显强于模型组。推测姜黄素有可能通过抗自由基，调节脂质代谢，减少过氧化脂质的生成，干扰ADMA的生成和代谢，进而促进NO合成、释放以及释放后的作用，提高EPCs活性，从而达到保护内皮功能，而表现为抑制动脉粥样硬化病变进展的作用。
姜黄素对EPCs的影响尚未见文献报道，本实验通过姜黄素对实验性AS影响的研究，提示姜黄素能通过调节血浆ADMA水平，影响NO和EPCs，达到对抗AS的作用，为冠心病的预防和治疗提供一种新方法、新策略，在动脉粥样硬化的防治中的应用具有较为广阔的前景。但在临床中使用姜黄素预防和治疗AS，尚待进一步深入观察。
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（收稿日期：2013_4_8）