微生物产弹性蛋白酶制取方法的探讨

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摘要：目的探讨微生物产弹性蛋白酶的制取方法。方法将产弹性蛋白酶的枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中，摇床发酵培养后，离心收集发酵液，并经过硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤纯化弹性蛋白酶。结果经过上述纯化步骤，弹性蛋白酶纯化倍数达到了33倍，回收率达到12 %，酶蛋白比活达到了528 U/mg 。结论此纯化工艺较为理想，获得了较纯的酶蛋白。

关键词：弹性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；分离；纯化

中图分类号：Q939.97文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)11-0040-03

Approach on Preparative Method of Elastase Produced by Microorganism

FANG Shang-ling, HU Jia- jun , ZHU Nan

（College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068 ,China）

Abstract：Objective To investigate the preparative method of elastase produced by microorganism. Methods A elastase-producing strain of Bacillus subtilis was inoculated into fermentation medium and cultivated on a rotary shaker。The broth was collected by centrifugation. The purification of elastase was achieved by combination methods of (NH4)2S04 fractionation, anion exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-25 and gel filtration chromatography on Sephadex G-75. Results Through the purification procedures shown above, the purification multiple of elastase was 33, the recovery rate was up to 12 % and the specific activity was about 528 U/mg.Conclusion The purer elastase can be obtained by this ideal purification technology.

Key words：elastase; Bacillus subtilis; separation; purification

弹性蛋白酶（elastase）是一种以降解不溶性弹性蛋白质为特征的水解酶，此酶属于丝 氨酸蛋白酶，可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得。从胰脏提取的弹性蛋白酶价格较高，因此，采用微生物发酵法生产弹性蛋白酶具有广阔的应用前景[1]。本研究以微生物发酵液为原料，采用盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析方法进行弹性蛋白酶纯化，并结合SDS-PAGE对纯化酶进行测定。

1材料

1.1菌种

弹性蛋白酶生产菌株枯草芽孢杆菌B1由本实验室筛选并分离。

1.2试剂

弹性蛋白、刚果红-弹性蛋白（Sigma公司）；K2HPO4（上海恒信化学试剂有限公司）；DEAE-Sephadex A-25，Sephadex G-75（Pharmacia公司）。

1.3仪器

磁力搅拌器（江苏岸头分析仪器厂）；旋转式摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；电热干燥箱（江苏海门县三和农具厂）。

1.4培养基

发酵培养基（w/v）：干酪素3.0 g，葡萄糖4.0 g，玉米提取液0.2 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4・7H2O 0.01 g，pH 8.8。115 ℃下灭菌30 min。

种子培养基（w/v）：牛肉膏0.4 g、 蛋白胨0.6 g、酵母膏0.2 g、NaCl 0.5 g，pH 8.8。121 ℃下灭菌20 min。

2方法

2.1丙酮沉淀法提取弹性蛋白酶

发酵液在4 ℃、5 000 r/min条件下离心30 min，去除菌体，上清液置冰浴中。取上清液，加入与上清液等体积的预冷丙酮，充分搅拌后在4℃下静置30 min。4 ℃，5 000 r/min离心30 min，弃上清液，即得酶蛋白粗品。收集后测定酶活性。

2.2酶的分离纯化

2.2.1pH值对盐析的影响加入65%的硫酸铵作盐析时的沉淀剂，测量不同pH条件下沉淀出酶的活性，确定最适盐析pH值。

2.2.2盐析时硫酸铵最佳浓度的确定发酵液在4 ℃，5 000 r/min条件下离心30 min，去除菌体。冰浴条件下向发酵液中缓慢加入不同量的硫酸铵，盐析液在4 ℃下静置过夜。4 ℃，5 000 r/min离心30 min，分别收集酶蛋白和上清液。将收集的酶蛋白粗品溶于0.02 mol/L、pH 8.0的100 mL Tris-HCl缓冲液中透析，测定酶活性，并确定硫酸铵的最佳盐析浓度。

2.2.3DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析盐析、透析后的酶液采用聚乙二醇浓缩至适当浓度后过离子交换柱。洗脱液检测A280值，吸附的蛋白质用NaCl溶液连续线性洗脱。NaCl浓度0~0.6 mol/L，共800 mL，流速为5 mL/min，每管收集5 mL。分别测定各管A280值和酶活性，合并具有活性的各管溶液，并检测酶液的酶活性。

2.2.4Sephadex G-75凝胶过滤层析[2]收集经过离子交换柱的酶液，用聚乙二醇浓缩至4 mL，加入用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液平衡过的Sephadex G-75凝胶柱中，洗脱并分部收集，流速为5 mL/min，每管收集5 mL，分别检测各管A280值和酶活性。

2.2.5SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）按照Laemmli方法，采用DYY-Ⅲ型垂直板电泳槽进行SDS-PAGE，电泳后的凝胶直接银染或考马斯亮蓝染色。

3结果与讨论

3.1丙酮沉淀法制取弹性蛋白酶的结果

对经丙酮沉淀纯化后的粗酶进行SDS-PAGE凝胶电泳，在相对分子质量32 ×103处有一条单一的蛋白质条带，与文献报道的弹性蛋白酶相对分子质量大小基本一致。结果见图1。

3.2pH值对盐析的影响

酶在等电点或接近等电点时溶解度最低，所以，需要调整发酵液的pH值尽量接近等电点。图2是硫酸铵浓度65 ％时，不同pH条件下弹性蛋白酶酶活性的测定结果。由图2可见，pH4.91时，沉淀所得酶的活性较高，为144.9 U/mL；pH7.1时，沉淀所得酶的活性较低，为128.8 U/mL。因此，在酶分级沉淀的第1步去除杂蛋白质时，将发酵液pH调至7.1，第2步沉淀酶时，可将pH调至4.91。

3.3硫酸铵分段盐析实验结果

透析结束后测酶活性，结果见图3。硫酸铵浓度为65 ％时酶活性较高，可达434.7 U/mL。综合考虑酶的得率和酶活性，应收集硫酸铵浓度30 ％~65 ％之间的沉淀。经过硫酸铵分段盐析，酶活性提高了3.45倍，达到434.7 U/mL。

3.4DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析结果

以洗脱液收集管数为横坐标，蛋白质A280值为左纵坐标，洗脱时NaCl浓度为右纵坐标，绘制的洗脱曲线见图4。由图4可见，NaC1浓度为0.125～0.400 mol/L时洗脱出多个蛋白质峰。表明盐析、透析后的酶液仍含有杂蛋白质。通过洗脱已将多种蛋白质分离开。NaC1浓度高于0.4 mol/L时，基本没有蛋白质洗出。洗脱液第46～63管，有酶活性存在，第55、56管酶的活性最高。NaC1浓度0.154～0.187 mol/L时，即可将弹性蛋白酶洗脱下来。

3.5Sephadex G-75凝胶过滤层析结果

合并经过阴离子交换层析后有活性的收集管内溶液，透析、浓缩后用凝胶过滤层析柱纯化。横坐标为收集管数，纵坐标为A280吸收度值，绘制洗脱曲线，结果见图5。

由图5可见，有2个大的和1个小的蛋白质洗脱峰，大峰没有酶活性，小峰有酶活性。表明经过离子交换层析后的酶液还含有杂蛋白质，且杂蛋白质的量高于酶的量。在收集管26～38号出现弹性蛋白酶的活性峰。

4结论

综上所述，通过盐析，离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析后得到较纯的酶，结果见表1。最终弹性蛋白酶纯化倍数为33倍，酶比活达到528 U/mg，但回收率有待提高。

参考文献

[1]陈丽娟，刘宇峰，夏海华，等. 枯草杆菌产弹性酶及提纯工艺研究[J]. 生物技术，2003，13（1）：20-21.

[2]颜子颖，关国雄，张维钦，等. 胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选及酶的纯化[J]. 微生物学报，1995，35（1）：50-57.

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”