鹅细小病毒vp2基因工程亚单位疫苗的免疫试验(全文)

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摘要：为研究鹅细小病毒（GPV）vp2蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果，本试验对GPV延边分离株的vp2基因进行原核表达，将Western-blot试验鉴定为阳性的表达蛋白进行乳化，免疫BALB/c小鼠，应用ELISA方法监测试验动物的体液免疫水平，以此评价该疫苗的免疫效果。结果表明，在三免后2d，重组蛋白佐剂组检测到的血清OD450nm值达0.687，而生理盐水阴性对照组为0.038，两者差异极显著（P

摘要：为研究鹅细小病毒（GPV）VP2蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果，本试验对GPV延边分离株的vp2基因进行原核表达，将Western-blot试验鉴定为阳性的表达蛋白进行乳化，免疫BALB/c小鼠，应用ELISA方法监测试验动物的体液免疫水平，以此评价该疫苗的免疫效果。结果表明，在三免后2d，重组蛋白佐剂组检测到的血清OD450nm值达0.687，而生理盐水阴性对照组为0.038，两者差异极显著（P

关键词：鹅细小病毒；基因工程亚单位疫苗；免疫试验

中图分类号：S835 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-01-0171-1

基金项目：吉林省自然科学基金面上项目（201215230），吉林省牧业管理局项目(吉牧科字第200902号)。

细小病毒（Goose Parvovirusis，GP）呈世界性分布，发病率和病死率均较高，临床一旦发病，无有效的治疗办法，严重危害本地区养鹅业的健康发展[1]。目前，国内外用于GP的预防主要以传统疫苗为主，基因工程疫苗尚属探索阶段，尚缺乏GPV基因工程疫苗诱导雏鹅细胞免疫和体液免疫的系统研究资料。在GPV的三个结构基因中，Le Gall-Recule等[2]利用杆状病毒表达系统，证明表达的番鸭细小病毒vp2基因具有抗原性和免疫原性。本研究拟对GPV的vp2基因进行原核表达，制备基因工程亚单位疫苗，并进行免疫试验分析，为GPV的vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c小鼠购自哈尔滨兽医研究所；弗氏佐剂购自sigma公司；其他载体与试剂由延边大学预防兽医实验室提供。

1.2 GPV延边株vp2基因工程亚单位疫苗的制备

采用常规方法提取GPV延边株的基因组DNA，以特异引物[3]扩增vp2基因片段，构建原核表达载体pET30a-vp2，并在大肠杆菌中诱导表达，将Western-blot鉴定为阳性的蛋白进行亲和层析纯化，纯化后重组蛋白与弗氏佐剂混合乳化，制备GPV的基因工程亚单位疫苗。

1.3 vp2基因工程亚单位疫苗的动物免疫试验

免疫试验共分3组，每组10只BALB/c小鼠，分别为接种VP2重组蛋白组，VP2重组蛋白加佐剂组和生理盐水对照组。在每一次免疫前采血分离血清，第3次免疫后的第2d、4d、6d分别采血分离血清，均存于-20℃备用。

1.4 ELISA监测血清VP2抗体水平

用纯化的VP2重组蛋白为抗原包被反应孔，以小鼠抗GPV阳性血清为一抗，以山羊抗小鼠HRP-IgG为二抗，进行ELISA检测实验小鼠血清中抗体水平，并分析vp2基因工程亚单位疫苗对实验小鼠的体液免疫水平。采用SAS软件对试验数据进行分析。-IgG为二抗，进行ELISA检测实验小鼠血清中抗体水平，并分析vp2基因工程亚单位疫苗对实验小鼠的体液免疫水平。采用SAS软件对试验数据进行分析。

2 结果

2.1 GPV vp2基因的原达表达

对pET30a-vp2进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE与Western-blot试验表明，在经考马斯亮兰染色的SDS-PAGE胶上和NC膜上均出现VP2特异性条带（图略），百未诱导的重组菌未出现特异条带。

2.2 GPV重组VP2蛋白的体液免疫水平

对采集的BALB/c免疫小鼠血清进行ELISA试验检测，每个样品重复检测三次，取平均值计算，详见表1。经统计学分析表明，在三免后第2d，重组蛋白组和重组蛋白佐剂组免疫小鼠血清的OD450nm值均达到最高值，重组蛋白佐剂组与生理盐水阴性对照组间差异极显著（P

表1 免疫后BALB/c免疫小鼠血清中抗体消长变化（OD450）

组别一免前二免前三免前三免后2d 三免后4d 三免后6d

重组蛋白组 0.039±

0.015 0.312±0.012 0.434±0.022 0.536±0.031 0.480±0.036 0.245±

0.017

重组蛋白佐剂组 0.033±

0.032 0.498±0.017 0.663±0.028 0.687±0.036 0.569±0.037 0.461±

0.019

生理盐水组 0.037±

0.013 0.031±0.015 0.039±0.015 0.038±0.015 0.034±0.015 0.030±

0.015

3 讨论

本研究以GPV的vp2基因为目的基因，以pET30a为表达载体，在体外高效表达了VP2蛋白，经重组蛋白免疫小鼠试验发现，该重组蛋白具有免疫活性，重组蛋白佐剂组与阴性组间血清抗体水平差异极显著，说明vp2基因可以作为基因工程疫苗的候选基因，而重组蛋白佐剂组与重组蛋白组间血清抗体水平差异显著，提示佐剂对基因工程亚单位苗的免疫效果影响较大。由于本研究只是初步的预试验，未进行攻毒试验和鹅体内试验，这将在下一步试验中予以开展。本研究结果为GPV vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。

参考文献

[1] 方定一.小鹅瘟的介绍[J].中国兽医杂志,1962,8:19-20．

[2] le Gall-Recule, Jestin V,Chagnaud P.Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins [J].J GenVirol,1996,77(9):2159-2163.

[3] 胡晓静,潘杰,陈进喜,等.2株鹅细小病毒主要结构蛋白vp2基因的克隆和序列分析[J].现代农业科技,2008,(23):262-265.

作者简介：高旭(1977-)，男，吉林德惠人，博士，副教授，研究方向：动物病毒病分子生物学与免疫学。

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鹅细小病毒vp2基因工程亚单位疫苗的免疫试验

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