脂肪干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

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摘 要：目的：探讨将脂肪干细胞定向诱导分化为成骨细胞的方法并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。 方法：取行脂肪抽吸术患者的脂肪组织，I型胶原酶消化进行培养，贴壁细胞传代，取第2代细胞进行诱导，培养基中添加成骨诱导剂地塞米松（0.01μM）、β-磷酸甘油钠（10mM）、2-磷酸抗坏血酸（50μM）和1,25-(OH)2VitD3（10mM）。鉴定诱导细胞的成骨特性：碱性磷酸酶(AKP)定量检测，免疫荧光化学检测骨钙素（OCN）、骨桥素（OPN）、I型胶原表达，Alizarn Red染色检测钙结节形成，RT-PCR检测AKP和OPN表达。 结果：第2代脂肪干细胞诱导后AKP表达自第3天起各个检测点（第3、7、14、21、28天）诱导组与对照组差异皆具有统计学意义（P

关键词：组织工程骨；脂肪干细胞；成骨诱导；成骨分化

中图分类号：R446.6文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2680-02

Inducing Human Adipose-derived Stem Cells Into Osteoblasts Directionally And

Identification of Their Osteogenesis Characteristics

LIU Bo, ZHU Jintu, CAO Yi, GAO Shousong, YU Tu-gen

(Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Zhejiang Traditional Chinese Medicine Hospital,Hangzhou 310006,Zhejiang,China)

Abstract:Objective:To study the method of inducing human adipose-derived stem cells (ADSCs) into osteoblasts directionally and to identify osteogenesis characteristics. Methods: ADSC was isolated from liposuction aspirates using digestion method by I type collagenase and passage 2 cells were cultured in conditioned medium containing 0.01μM dexamethasone, 10 mMβ-glycerophosphate, 50μM ascorbate-2-phosphate and 10mM 1,25-dihydroxyvitamin D3.The induced cells were chosen to check osteogenesis characteristics, including alkaline phosphatase quantitative assay, osteocalcin, osteopontin and collagen_I assay by immunoflurorescence,and calcium nodes assay with Alizarn Red staining. RT-PCR was used to assay alkaline phosphatase and osteopontin. Results: The expression of AKP is positive at several detecting times, and the osteopontin,collagen_I, and osteocalcin were positive by immunoflurorescence method in experimental group after induced 14 days, and calcium nodes were seen by Alizarn Red staining in induced cells. AKP and OPN expression or experimental group were detected by RT-PCR method. Conclusion: The induced human ADSCs had typical osteogenesis characteristics.

Key words:tissue engineering bone; adipose-derived stem cells; osteogenic induction; osteogenic differentiation

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收稿日期：2011-07-30

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（Y2080180）

作者简介：刘波（1978-），男，山东诸城人，主治医师，硕士，研究方向：脂肪移植治疗的基础与临床研究。种子细胞的来源是组织工程的基本问题。众多学者一直在寻找具有强大的体外增殖力和多向分化潜能的干细胞，现已成功获得骨髓间充质干细胞（BMSCs），并证明其能向多种中胚层组织细胞分化，极大推动了组织工程学的发展。近年有学者注意到，在某些病理情况下脂肪中有异位骨形成，这表明脂肪组织中可能存在某些细胞可分化为其他组织细胞。2002年，Zuk\[1\]从脂肪抽吸物中分离到具有多向分化潜能的干细胞，以后的学者将其命名为ADSCs(Adipose -derived stem cells)。脂肪干细胞因其来源广泛，经脂肪抽吸术即可大量获取，成为现今组织工程领域研究热点之一。本文旨在探讨人脂肪干细胞体外成骨的特性。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂 脂肪抽吸物均来自浙江省中医院整形外科门诊行脂肪抽吸术的患者；DMEM低糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均为Gibco公司产品；β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸及1,25-(OH)2VitD3均为Sigma公司产品；OPN、OCN、I型胶原一抗为CHEMICON公司产品，二抗为Santa Cruz公司产品。

1.2 脂肪干细胞培养与传代 无菌条件下将脂肪抽吸物用PBS反复冲洗，尔后移入离心管，加入等体积的0.075%的I型胶原酶消化，37℃、1h,加带血清培养液终止消化，离心1380r/min，10min，弃去上清，用100目细胞滤器过滤，再离心1380r/min，5min，弃去上清，加入含10％胎牛血清DMEM低糖培养液混匀细胞，以2×104/cm2接种于100mm培养皿中培养。24h后，可见梭型细胞贴壁，每3天更换培养液一次，待细胞融合至80％～90％时进行传代，传代密度为1×104/cm2。扩增到第2代后，换成骨诱导液。

1.3 AKP定量检测 将底物 40mg(1粒)溶解于10mL去离子水中备用；取5支15mL离心管分别标记空白等，各放入0.5mL缓冲液和0.5mL底物水溶液，37℃水浴10min；每盘细胞PBS冲洗后，加入3mL Tris (ph7.4)，将细胞刮下，吸入离心管，超声震荡粉碎（90s,间隔9s, 4℃）；取01mL混合震荡液加入已标记的离心管中，空白组加入0.1 mL去离子水，继续37℃水浴15min；加入10mL 0.05N NAOH终止，405nm分光光度计测光密度值（吸光度），以空白对照组进行调零。（0.0815OD值=1 Sigma U，1 Sigma U=1μmol p-nitrophenol/h）。

1.4 细胞免疫荧光分析OPN 、OCN 及I型胶原表达 细胞爬片经PBS冲洗两遍，每次5min，加入95％丙酮固定10min，PBS适当冲洗，10％羊血清封闭30min，加一抗（OPN、I型胶原为兔抗人多克隆抗体，OCN为鼠抗人单克隆抗体）4°C过夜，PBS适当冲洗，二抗（OPN、I型胶原FITC标羊抗兔多克隆抗体，OCN为FITC标羊抗鼠多克隆抗体）37°C孵育30min，PBS适当冲洗，1∶ 1000稀释PI(Sigma公司)37°C孵育10min，PBS漂洗后封片，荧光显微镜观察。

1.5 Alizarn Red 染色-检测钙结节形成 以未诱导组作为阴性对照。诱导28天，4％多聚甲醛固定30min，PBS适当冲洗，加入0.1％Alizarn Red-Tris-Hcl 溶液（pH83），室温，10min。PBS适当冲洗，干燥封片。

1.6 RT-PCR检测AKP、OPN表达 分别收集对照组和实验组在培养和诱导14天后细胞，加入Trizol抽取mRNA，进行逆转录反应，得到的cDNA进行PCR扩增,反应条件94°C变性，55°C退火，35个循环。引物序列。

1.7 统计学方法 结果数据以均数士标准差(±s)表示，组间采用Student-Newman-kewls方法进行比较。P＜005认为有显著性差别，统计软件包为SAS Ver.6.12。

2 结 果

2.1 AKP定量检测 AKP在第3天开始出现，14天达高峰，随后下降。自第3天起各个检测点（诱导3、7、14、21、28天）诱导组与对照组差异具有统计学意义（P

2.2 细胞免疫荧光分析OCN、OPN 及I型胶原表达 诱导14天,实验组细胞OCN表达阳性，胞浆内出现黄绿色荧光见插页Ⅲ图2A，OPN表达阳性见插页Ⅲ图2B，I型胶原表达阳性见插页Ⅲ图2C。

2.3 钙结节Alizarn Red 染色 诱导14天，实验组细胞外散在出现钙盐沉积，28天达高峰，细胞外有大量钙结节出现。Alizarn Red 染色为红色结节见插页Ⅲ图3。

2.4 RT-PCR检测AKP、OPN AKP（14天） RT-PCR检测结果：显示大约400bp与500bp之间诱导组出现阳性表达，未诱导组未见阳性表达。OPN（14天）检测，大约300bp与400bp之间诱导组出现阳性表达，未诱导组也有表达，但明显弱于诱导组，见插页Ⅲ图4。

3 讨 论

骨组织工程研究的重要内容之一是寻找具有取材容易、体外扩增能力强、易定向诱导分化等优点的种子细胞。2002年国外学者Zuk从脂肪抽吸物中分离到脂肪干细胞，体外证明具有多向分化潜能以来。脂肪干细胞因其来源广泛，经脂肪抽吸术即可大量获取，成为现今组织工程领域研究热点之一。

研究发现，ADSCs在含地塞米松、β－磷酸甘油、维生素C、1,25(OH）2VitD3的诱导下，能够向成骨细胞分化。其中地塞米松在成骨分化早期以促进基质合成为主，调控分化细胞中基因表达，提高AKP活性，促进向成骨细胞转化，后期以促进钙化为主，是体外人间充质干细胞（hMSCs）成骨分化的必需成分。β-甘油磷酸钠可以提供骨组织在体外培养体系中发生沉淀所需的磷离子，从而加速结节的钙化细胞\[2-3\]。维生素C的作用主要是促进体外培养细胞合成胶原、形成钙化，同时可调节AKP活性，而AKP在成骨细胞体外钙化中起决定性作用\[3\]。成骨细胞有1,25-(OH)2VitD3的受体，1,25-(OH)2VitD3的主要作用是直接作用于细胞膜的受体，调节细胞对钙离子的转运，促进钙磷代谢，在诱导培养液中加入1,25-(OH)2VitD3能促进间充质干细胞向成骨细胞表型转化，同时抑制软骨细胞的分化，并维持成骨细胞的分泌与代谢活动，这是重要的诱导条件之一\[4\]。

检测细胞是否分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(AKP)活性增强和细胞外基质钙化是两个重要标志。AKP是成熟成骨细胞标志酶之一，目前普遍认为，AKP在体外钙化中起着关键的作用。如果没有AKP活性，钙化就不会发生，其主要机制在于AKP能够水解有机磷酸酶，使局部PO-43浓度升高，结合钙，并可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化\[5\]。AKP定量检测表明在我们以上诱导条件下，AKP在第4天开始出现，14天达高峰，随后下降。RT-PCR也证实了诱导后AKP基因水平的表达。AKP活性增强与钙沉积是不同步的，AKP活性增强是钙化出现的前提。诱导14天，细胞外散在出现钙盐沉积，28天达高峰，细胞外有大量钙结节出现。Alizarn Red 染色为红色结节。

成骨细胞分泌的蛋白以Ｉ型胶原为主，是骨组织的支架，实验表明成骨诱导前后，免疫荧光都检测到其表达。OPN和OCN都是成骨过程中的重要蛋白质，能够促进成骨过程钙磷沉积。然而OPN并不特异，其他细胞也有表达，但RT-PCR显示诱导组较非诱导组表达增强。OCN是成骨细胞特异的蛋白质，诱导14天后，免疫荧光显示其表达。以上实验表明我们应用以上诱导培养液能够将第二代的脂肪干细胞诱导为成骨细胞。

对脂肪干细胞的研究才刚刚开始，各实验室的结果也不尽相同，进一步的研究还有待于深入进行。但现有的研究资料已经预示了ADSCs广泛的应用前景。

参考文献

［1］ Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells\[J\]. Mol Bio Cell,2002,13:4279 4295.

\[2\] Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues \[J\]. Science,1997,276(5309): 71-74.

\[3\] Conget PA, Minguell JJ. Phentotypical and functional properies of human bone marrow mesenchymal progenitor cells \[J\]. J Cell Physiol,1999,181(1): 67-73.

\[4\] Tjabringa GS, Zandieh-Doulabi B, Helder MN,et al.The polymine spermine regulates osteogenic differentiation in adipose stem cells\[J\].J Cell Mol Med, 2008, 12(5A): 1710-1717.

\[5\] Majunldar MK, Thiede MA, Mosca JD, et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cell) and stromal cells \[J\]. J cell Physiol, 1998,176(1):57－66.