热休克蛋白70基因的序列分析

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[摘 要]利用对苜蓿夜蛾的热休克蛋白的克隆分析，了解苜蓿夜蛾的热休克蛋白DNA结构。

[关键词]热休克蛋白；特性；序列分析

1 热休克蛋白的介绍

1.1 热休克蛋白国内外研究现状

1.1.1热休克蛋白

热休克蛋白又称热应激蛋白，是机体在应激情况下细胞内迅速合成的一组蛋白质，具有高度的保守型以及应激性，普遍存在于从细菌到人的整个生物界中。当生物细胞在受热、受损、应激刺激（如缺血、缺氧、重金属离子、射线、病毒感染、DNA损伤等）作用下，都会发生热休克反应，抑制一些正常蛋白质的合成、折叠，致使疏水区暴露相互聚集结合形成不溶性沉淀，与此同时细胞启动热休克蛋白基因，合成热休克蛋白，阻止蛋白的相互结合。

小分子量Hsp家族蛋白质降解，类杭原加工.淋巴细胞回巢.自身免疫性。其中，Hsp70家族是生物体内最保守的和最重要的热休克蛋白家族，它在原核生物和真核生物体内都存在，并存在于所有的细胞区室和器官中。

1.2热休克蛋白70

1.2.1热休克蛋白70

Hsp70家族是分子量在70KDa左右的热休克蛋白，其不仅能在热胁迫下表达，而且也组成性的存在于所有的活体细胞中。Hsp70家族是Hsp中最保守的一类。Hsp70家族主要包括结构型Hsc70和诱导型Hsp70两种类型。当谈及Hsp70时就是指Hsp70和Hsc70。这两种蛋白质的氨基酸序列有90%是相同的，它们的生化性除了电泳泳动度稍有差异外，其它大部分特性也是相同的。

1.2.2热休克蛋白70的特性：

Hsp70家族的成员由于其氨基酸有很高的同源性、蛋白结构上的相似性，所以它们具有一些共同的生物学性质。Hsp70家族具有弱的ATP酶活性，与肌肉的肌动蛋白结构很相似，当ATP酶活性被激活时可与伸展的多肽结合，并且它具有保护生物体中各种酶免受热损伤，使聚合的蛋白质解聚等生化特点

1.2.3热休克蛋白70的功能：在众多种类的Hsp蛋白中，最重要的是Hsp70，而且也是现在研究最多、最深入的。Hsp70具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能、抗细胞凋亡功能、参与免疫反应、抗氧化功能、提高细胞的应激耐受性等。

2 实验方法

2.1苜蓿夜蛾RNA提取苜蓿夜蛾的总RNA是从苜蓿夜蛾四龄幼虫的整个虫体中提取出来的，提取方法参照上海生工出产的RNA提取试剂盒中的说明并结合试验中具体条件以及情况进行改进。在提取总RNA前，先将幼虫在38℃热刺激下3h。

2.2 RNA的检测

RNA检测采用甲醛变性电泳法和紫外吸收法（参照分子克隆实验指南）相结合的办法，利用RT-PCR扩增保守区之间的cDNA序列，根据Genebank中的烟草天蛾（AY220911）、甘蓝夜蛾（AB251895）、粘虫（EU306518）和家蚕（FJ573459）四种鳞翅目昆虫的热休克蛋白Hsp70基因的mRNA序列进行比较后，找到并通过保守区域设计了一对引物：

为cDNA合成的引物，反转录得到的cDN段以HelupHsp70和HellowHsp70为引物进行PCR扩增。

3 实验结果

3.1苜蓿夜蛾总RNA的提取，平行做三个重复，都是苜蓿夜蛾总RNA电泳条带。总RNA中约有98%-99%的RNA是核糖体RNA，因而总RNA的完整性可以通过检测核糖体RNA（rRNA）来判断。 通过测定试验所提取的RNA的吸光度值可以计算RNA的浓度。测序结果进行去载体处理后得到1816bp长度的基因特异性片段。之后和NCBI Blast 进行比对，发现与其同源的已发表的序列大多为昆虫Hsp70基因，并且得到的苜蓿夜蛾Hsp70基因特异性片段与甘蓝夜蛾Hsp70基因（登录号为：AB251895.1）具有94%的同源性，确定得到的苜蓿夜蛾特异性基因序列属于热休克蛋白Hsp70家族。

3.2热休克蛋白的提取。热休克蛋白70标签序列中：333aa-347aa（这一标签序列的第333aa处不同，在第344aa处不同，在第345aa处不同（分别是异亮氨酸、亮氨酸），在347aa处不同。分析上述不同位置的不同氨基酸大部分都是都是同一家族的氨基酸，不但有些具有相同的分子组成，只是结构上不同以外，还是相同的氨基酸家族，虽然有差别但还可以称为是热休克蛋白的标签序列。

3.3昆虫HSP70分析。从昆虫Hsp70氨基酸聚类分析图中得知：苜蓿夜蛾HelHsp70基因的氨基酸序列与甘蓝夜蛾首先聚类，之后与日本柞蚕、竹蠹螟在聚类，与粉茎螟聚类后又与烟草天鹅聚类也就是鳞翅目昆虫聚类完毕后与鞘翅目昆虫聚类，之后再与双翅目昆虫聚类，再与膜翅目昆虫聚类，最后与同翅目昆虫聚类。各种昆虫的Hsp70的聚类分析图显示进化分类地位与传统的分类结果大致相同。

结论：

1.本试验中提取的苜蓿夜蛾总RNA经过1%琼脂糖凝胶电泳后的条带28s和18s的亮度比是1：2，宽度比是1：2。昆虫的总RNA在变性电泳时，28S rRNA与18S rRNA在比例上不呈2：1的关系。

2.序列分析找到了Hsp70家族的三个标签序列出现在已得到的HelHsp70基因氨基酸序列中确定了HelHsp70蛋白分子的疏水区和亲水区；明确了此蛋白分子中并无O-糖基化位点存在，这也说明了HelHsp70基因的保守性；对得到的HelHsp70基因的ORF进行限制性酶切分析，得到酶切图谱为进行下一步的与达载体的连接和原核表达进行准备；通过软件模拟了其蛋白质二维结构图和三维分子结构图。

3.通过序列比对绘制的聚类分析图来看，与其他生物比较时苜蓿夜蛾HelHsp70基因的氨基酸序列与库蚊、赤拟古盗首先聚类，其次是长体茧蜂，哺乳动物中的人、黑猩猩、黄牛、原属鸡聚类，之后两栖动物和鱼类聚类，之后是植物。与其他种类的昆虫比较苜蓿夜蛾HelHsp70基因的氨基酸序列与甘蓝夜蛾首先聚类，之后与日本柞蚕、竹蠹螟在聚类，与粉茎螟聚类后又与烟草天鹅目昆虫聚类，之后再与双翅目昆虫聚类，再与膜翅目昆虫聚类，最后与同翅目昆虫聚类。Hsp70的聚类分析图的显示与传统的分类结果大致相同，说明了Hsp70基因的高度保守性。（编辑/李舶）