延迟荧光强度及光谱分析技术在逆境光合生理检测中的应用
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摘要：延迟荧光（Delayed Fluorescence, DF）技术是植物光合器官在停止光照后的一种超微弱长期发光现象。文章以延迟荧光检测及应用技术为核心，围绕逆境（盐、紫外辐射）胁迫下延迟荧光强度及发射光谱峰值比F730/F685的变化规律展开实验研究。研究结果表明，与通常采用的对胁迫敏感的叶绿素荧光参数Fv/Fm一样，延迟荧光强度及发射光谱峰值比F730/F685可以有效检测不同逆境胁迫下植物的光合生理。
中图分类号：R318.51 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-11-0041-2
1 逆境胁迫对植物的伤害及传统检测方法
逆境胁迫是导致农业生产力水平不高、植物资源和物种信息丧失的主要因素。在众多的逆境胁迫中，尤以高温、盐及紫外辐射胁迫对植物的伤害最为显著。分析逆境胁迫下植物的生长发育情况、光合生理变化及生理生化特性，对抗逆性植物选育及培养，对提高农作物的抗胁迫能力以及促进农业生产、经济发展等都有着重要的理论和现实意义。
盐胁迫主要包括渗透胁迫、离子毒害以及高盐引起的营养亏缺、氧化胁迫等一系列的次生胁迫[1]。这些胁迫会抑制植物的生长发育、破坏细胞膜结构、破坏酶活性、影响呼吸作用、破坏光合系统、影响光合功能、增加植物体内有毒物质的积累最终加速植物衰老或死亡。目前公认的与植物盐胁迫有关的生理生化指标主要有：渗透调节物质（无机离子、脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖）；渗透保护物质；抗氧化物酶系统及丙二酮（MDA）；光合作用相关指标等。
臭氧层变薄主要导致到达地表的中波紫外辐射(UV-B，280-320nm)增强，这一全球气候变化的重要环境问题已引起世界各国广泛关注。UV-B胁迫对植物的影响是多方面的，包括植物的生长发育、生殖遗传、作物品质及农艺性状等。UV-B辐射可诱导植物在形态学上发生一系列的变化，比如植株矮化、节间缩短、叶面积缩小、叶面积指数降低、改变根冠比例等。当植物受到UV-B胁迫以后，叶片的净光合速率、净同化率和气孔传导率都受到显著的抑制，导致植物光合能力的下降[2]，UV-B对植物体内的某些物质代谢造成严重影响，最终减少植物的总生长量。
对植物在盐及紫外胁迫逆境下生理生态及光合功能的检测方法基本都采用传统的生理生化指标检测法，虽然传统方法对胁迫损伤程度判断较为准确，但样品制备过程繁琐、检测步骤复杂，不利于实际的应用和推广。而对于胁迫下植物光合生理的检测，目前通常采用基于红外线气体分析技术（IRGA）的光合能力检测法或叶绿素荧光分析法。这两种方法简单易行、对植物无破坏、参数丰富，但也存在着检测过程易受外界干扰、叶绿素荧光检测参数的变化规律因样本和条件而存在差异、参数波动大、参数混杂、检测仪器价格昂贵等问题，因此，在实际应用中也受到了阻碍，不利于其在农业生产中的普及和推广。
2 延迟荧光检测技术
延迟荧光（Delayed Fluorescence, DF）是生命体经白光或单色光诱发而产生的长程余晖的超微弱发光现象，广泛存在于一切生命活动之中。由于延迟荧光来源于光合电子传递链，它是研究体内、体外各种化学和物理因子对光合器官功能活性的良好手段，因此它比叶绿素荧光更有利于研究植物光合作用[3]，同时延迟荧光对胁迫因子的反应也比叶绿素荧光敏感[4]。可见，延迟荧光比叶绿素荧光更适于进行植物光合能力及环境胁迫检测。目前，延迟荧光已在生物医学、农业科学、食品工业和环境科学等研究领域显示出广泛的应用前景。
鉴于延迟荧光技术对胁迫因子的敏感性，本文对逆境（盐与紫外）胁迫下样品延迟荧光强度及发射光谱进行了实验检测，分析了植物延迟荧光强度及发射光谱尤其是光谱峰值比的变化与胁迫生理的关系。
3 实验材料和方法
3.1 样品培养
实验以玉米98-2离体叶片为样品，种子在潮湿滤纸上置于黑暗处萌发2天，然后播种在直径20cm，高24cm的含有培养土介质（泥炭:蛭石:沙=2:1:1）的塑料盆中，放入植物培养箱（Conviron, model E7/2, Winnipeg, Canada）中培养。光照周期为12小时，光照强度设定为400μmol・photons・m-2・s-1，相对湿度为80/85%(光/暗)。
3.2 胁迫环境设置
盐胁迫：分别将0、50、100、150、200、250、300mM浓度的NaCl加入样品的基本培养液中，总共进行24小时盐胁迫处理。
紫外胁迫：对样品叶片进行了2Wm-2强度的UV-B辐照短期胁迫实验。胁迫时间设定为2、4、6、8、10、12小时。对照为自然条件下的太阳辐射。
3.3 光合参数测量
延迟荧光强度采用本课题组自行研制的便携式延迟荧光检测系统测量。
延迟荧光光谱的采集采用光谱仪LS-55。
对胁迫敏感的叶绿素荧光参数Fv/Fm采用Imaging-PAM叶绿素荧光仪进行检测。
4 实验结果与分析
4.1 样品延迟荧光衰减信号及发射光谱
本文通过自行研制的延迟荧光检测系统采集得到的延迟荧光衰减信号如图1（a）所示（25℃环境下）。在本文中，主要分析样品逆境胁迫下的延迟荧光强度变化，而有关延迟荧光强度的计算是通过对动态衰减曲线的数据进行累加求和，单位为个（光子）/每秒（count per second,cps）。
根据样品激发谱的特性，选取680nm为激发波长，在室温（25℃）下对样品叶片进行了25℃环境下的发射光谱检测。为分析方便，实验结果均进行了单根发射光谱谱线最高峰值归一化处理。检测结果如图1（b）所示。由图1（b）可见，发射光谱的主峰在685nm附近，而在720-740nm附近有一个清晰可辨的次峰带。习惯上，将发射光谱685nm附近的主峰强度标记为F685，相应的，720-740nm附近的次峰强度标记为F730。通常认为，室温下，延迟荧光发射光谱685nm的峰主要来源于植物PSII[5]，而730nm峰则同时得益于PSI和PSII的共同贡献。
图1 样品的延迟荧光衰减信号及发射光谱
.（a）延迟荧光衰减信号 （b）延迟荧光发射光谱
4.2 两种逆境对样品延迟荧光强度及光谱峰值比的影响
通过对样品在逆境胁迫下的分析发现，发射光谱峰值的F730/F685随着胁迫环境发生了显著的变化（数据未列出）。因此，本文对延迟荧光强度、发射光谱峰值比F730/F685进行了实验分析。并与通常使用的叶绿素荧光分析技术中胁迫敏感参数Fv/Fm进行了对比。不同浓度盐胁迫下三者的关系由图2（a）所示。2Wm-2强度的UV-B胁迫下样品三个参数的关系示于图2（b）。
图2 盐胁迫或紫外胁迫下样品的延迟荧光强度、发射光谱峰值比F730/F685、叶绿素荧光参数Fv/Fm
（a）不同浓度盐胁迫,（b）不同照射时间紫外胁迫
由实验结果图2（a）可知：低浓度（50mM）NaCl溶液对玉米样品的光合作用起了轻微的促进作用，造成在此浓度下，光合功能加强，延迟荧光强度升高，F730/F685增加，由于Fv/Fm的是初始荧光与最大荧光的相对差异，因此，在非胁迫和胁迫微弱时，几乎没有变化。随着NaCl浓度的进一步升高，盐胁迫表现出对植物光合功能尤其是PSII的抑制作用[6]，延迟荧光强度降低，F730/F685比值减小。可见，随着胁迫浓度的增加，这三个参数具有相似的变化规律。
由图2（b）可见，延迟荧光强度、发射光谱峰值比F730/F68以及叶绿素荧光参数Fv/Fm三个参量均随着UV-B胁迫时间的延长而减小。三者的变化趋势相似。相对而言，F730/F685参量随胁迫时间变化的波动性稍大，这可能是由于F730/F685是对植物两个光系统在胁迫下共同受影响程度的分析，而PSII与PSI对蓝紫光的吸收存在差异，且对胁迫的反应程度不同，因此，造成参量的波动。
由图2的结果清晰可见，不论是在不同盐浓度胁迫下，还是在同一UV-B强度的不同辐照时间胁迫下，延迟荧光强度、延迟荧光光谱峰值比F730/F685、叶绿素荧光参数Fv/Fm均具有极为相似的变化规律。
5 结论
本文以玉米（98-2）为样品，分析了不同浓度NaCl胁迫、2Wm-2强度的UV-B胁迫不同时间后样品的延迟荧光强度、延迟荧光光谱峰值比F730/F685以及通常认为对胁迫敏感的叶绿素荧光参数Fv/Fm进行了实验检测。实验结果显示，三个参量在不同的逆境胁迫下有着相似的变化趋势，由于通常认为，Fv/Fm受逆境胁迫影响明显，可以进行逆境下植物光合器官损伤程度的判断，是一种检测植物逆境光合生理的有效指标，因此，有本文的实验结果可见，延迟荧光强度及光谱峰值比F730/F685也可以用于逆境下植物光合损伤的判断，也是检测植物逆境下光合生理的有效指标。
参考文献
[1] 宋凤斌,王晓波,等.玉米非生物逆境生理生态[J]. 北京:科学出版社, 2005:202-212.
[2] Vass I,Sass L,Spetea C, et a1. UV-B induced inhibition of photosystem II electron transport studied by EPR and Chlorophyll fluorescence. Impairment of donor and accept or side component.Biochem,1996,(35):8964-8973.
[3] Junsheng Wang, Da Xing, Lingrui Zhang, Li Jia. A new principle photosynthesis capacity biosensor based on quantitative measurement of delayed fluorescence in vivo[J]. Biosensors and Bioelectronics,2007,22(12):2861-2868.
[4] Lingrui Zhang, Da Xing, Junsheng Wang. A non-invasive and real-time monitoring of the regulation of photosynthetic metabolism biosensor based on measurement of delayed fluorescence in vivo, Sensors,2007,7:52-66.
[5] Margulies M M, Stresa G, Avron M, et al. Electron transport properties of chloroplasts from aged bean leaves and their relationship to the manganese content of the chloroplasts[C]. In:Proceedings of the Second International Congress on Photosynthetic Research.W. Junk N.V., The Hague. The Hague : W. Junk N. V.,1971.
[6] Murali NS,Teramura A11.Effects of supplemental UV-B radiation on the growth and physiology of field grow soybean[J].Environ and Experimental,1986,(3):233-243.
作者简介：李瑛（1979-）,女,贵州贵阳人，大连海事大学信息科学技术学院博士研究生，研究方向：光电与生物光子检测及仪器。