骨髓间充质干细胞全细胞抗原干预肺癌细胞系A549移植瘤生长的实验研究
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[摘要] 目的 观察骨髓间充质干细胞（MSCs）的全细胞抗原（WCAs）对人肺腺癌细胞株a549荷瘤的影响，并探讨肿瘤相关增殖抗原的改变揭示其可能的抑制机制。 方法 全骨髓贴壁法原代培养小鼠MSCs，取3～5代MSCs以15 Gy X线灭活获取WCAs，将BALB/c小鼠随机分成实验组和对照组，每组各24只。实验组皮下接种WCAs（1 次/3 d，共2周），获得免疫接种小鼠模型，对照组皮下注射同体积的磷酸缓冲液。观察两组小鼠肿瘤生长情况，测量肿瘤直径、计算肿瘤体积，并于接种后第7（Day7）、30天（Day30）行Western blot及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测增殖细胞核抗原（PCNA）及Ki-67因子的蛋白及mRNA水平。 结果 肺腺癌A549细胞皮下移植成功使小鼠荷瘤，实验组小鼠的肿瘤体积显著小于对照组（P < 0.05）；实验组PCNA蛋白水平显著低于对照组[Day7：（6.42±0.54）比（18.67±0.96），P < 0.01；Day30：（2.12±0.14）比（4.32±0.25），P < 0.05]；PCNA mRNA水平低于对照组[Day7：（11.64±0.28）比（25.18±1.37），P < 0.01；Day30：（2.11±0.18）比5.69±0.41），P < 0.01]；实验组Ki-67蛋白水平显著低于对照组[Day7：（1.57±0.51） 比（4.84±0.23），P < 0.05；Day30：（2.75±0.28）比（5.66±0.19），P < 0.01]；Ki-67 mRNA水平也明显下调[Day7：（2.12±0.43）比（5.94±1.03），P < 0.01；Day30：（3.71±0.72）比（8.62±0.35），P < 0.01]。 结论 采用MSCs获得全细胞抗原进行免疫应激可产生抑制肿瘤生长作用，其机制可能与及肿瘤增殖相关因子PCNA、Ki-67的下调有关，其内在的免疫分子机制有待深层次的探索。
[关键词] 骨髓间充质干细胞；肿瘤；免疫治疗
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（a）-0004-05
Research of vaccination with whole cells antigens from mesenchymal stem cells generate an antitumor effect of lung cancer cell line A549 in vivo
LI Jing1 CHEN Jun2 LI Xiuyu1
1.Department of Traditional Chinese Medicine， Navy General Hospital， Beijing 100048， China； 2. Department of Acupuncture and Massage， Shaanxi University of Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xianyang 712046， China
[Abstract] Objective To observe the influence of whole cell antigens （WCAs） of mesenchymal stem cells （MSCs） on lung cancer cell line A549， discuss the change of related antigen of tumor proliferation， and reveal the possible inhibition mechanism. Methods The MSCs was isolated and cultured adherent cells from marrow， and then 3-5 generations MSCs were inactivated by X-ray （15 Gy）， and the WCAs were obtained the BALB/c rats were divided into experimental group and control group randomly， with 24 rats in each group. The rats of experimental group were injected subcutaneous WCAs （1 time per 3 days， 2 weeks）， the control group immunized subcutaneously with PBS， the immunization mouse models were obtained. The growth of rats tumor were monitored， tumor volume was plotted， and the expression of PCNA， Ki-67 both in protein and mRNA level were monitored by Western blot and Real time-PCR respectively in 7 （Day7）， 30 d （Day30） after inoculation. Results A well-established lung cancer （A549） model was established， the tumor volume of mice in the experimental group was significantly less than that of the control group （P 0.05）； the expression of PCNA protein in experimental group were significantly lower than that of the control group [Day7： （6.42±0.54） vs （18.67±0.96）， P < 0.01； Day30： （2.12±0.14） vs （4.32±0.25）， P < 0.05]； level of PCNA mRNA was lower than that of the control group [Day7： （11.64±0.28） vs （25.18±1.37）， P < 0.01； Day30： （2.11±0.18） vs （5.69±0.41）， P < 0.01]； the Ki-67 protein of the experimental group was significantly lower than that of the control group [Day7： （1.57±0.51） vs （4.84±0.23）， P < 0.05； Day30： （2.75±0.28） vs （5.66±0.19）， P < 0.01]， the level of Ki-67 mRNA was also down regulated significantly [Day7： （2.12±0.43） vs （5.94±1.03）， P < 0.01； Day30： （3.71±0.72） vs （8.62±0.35）， P < 0.01]. Conclusion Vaccination of rats with MSCs generated consistent anticancer effect of lung carcinoma， which is further confirmed by low expression of PCNA and Ki-67 compared with controls. While the further immune mechanism need more exploring.
[Key words] Mesenchymal stem cells； Cancer； Immunotherapy
免疫治疗不仅能增强机体的主动抗肿瘤能力，识别杀伤肿瘤细胞，同时还避免了传统治疗的毒副作用。肿瘤特异性抗原和相关抗原能够激发机体的免疫系统，产生特异性抗肿瘤免疫，从而识别和杀伤肿瘤[1]。最新的理念认为，选取尽可能全面的肿瘤抗原作为应激抗原可以最大程度实现肿瘤免疫应激，从而激发抗肿瘤作用。因此，如何获取最为理想的肿瘤抗原成为肿瘤免疫研究的热点。当前，全肿瘤细胞抗原（WCAs）、树突细胞荷载肿瘤全抗原、抗原多重修饰等等研究正初步展开[2-3]；有意思的是，有学者基于肿瘤细胞与干细胞的相似性，提出通过“胚胎类物质”或“干细胞”等获得抗原进行荷瘤免疫，发现胚胎干细胞的WCAs对大肠癌细胞皮下移植瘤有明显抑制作用[4]。
目前，对于骨髓间充质干细胞（MSCs）全抗原对于肿瘤预防免疫应激的研究尚无报道。MSCs属于成体干细胞，存在于骨髓基质中可向三个胚层组织进行诱导分化，取材简单、培养容易，且其研究及临床运用均不存在伦理争议[5]。本研究采用MSCs为目的瘤苗制备WCAs，分次对小鼠进行预防接种后进行以人肺腺癌A549细胞荷瘤造模，观察肿瘤生长情况并初步探索分子机制。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
倒置显微镜（日本Olympus公司）；荧光定量PCR仪（日本TOYOBO东洋纺定量PCR仪器型号：Bio-red IQ5）；凝胶成像系统（美国ProteinSimple公司）；低温高速离心机（美国Beckman公司）。
1.2实验动物与主要试剂
BALB/c野生小鼠（军事医学科学院）；RPMI-1640、低糖型培养基（DMEM）（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；胰白酶干粉（美国Sigma公司）；10×多聚赖氨酸（北京中杉公司）；胶考马斯亮蓝（美国Sigma）；BCA蛋白浓度测定药盒（PIERCE公司）；丙烯酞胺（美国Sigma）；甲又丙烯酞胺（美国Sigma）；Tris碱（上海生工生物技术公司）；一抗anti-PCNA，anti- Ki-67（美国Santa）；二抗-辣根（北京中杉公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 MSCs培养、鉴定及A549培养 ①MSCs：全骨髓贴壁法培养MSCs，6周小鼠的股骨和胫骨，以10%胎牛血清（FBS）-低糖DMEM冲出骨髓，直接接种在培养瓶里，24～48 h后去悬浮，再接下来的每3～4天换液，直到需要传代。②人肺腺癌A549细胞：从液氮罐中取出A549细胞冻存管，放入37℃水浴锅中解冻，1000 r/min离心5 min，PBS吹打清洗重新离心后，以 10%FBS+5% RPMI-1640培养，每2～3天换液，直到需要传代。
1.3.2 MSCs全细胞抗原制备、免疫应激BALB/c小鼠及实验分组 X线照射裂解法获得抗原，具体如下调整3～5代A549细胞密度为1×106，接种于培养皿中行X线照射，照射强度为15 Gy；照射后的抗原4℃保存不超过6 h。获得WCAs后，根据是否接受抗原刺激将BALB/c小鼠随机分成两组，每组各24只；其中实验组小鼠每3天接受1次皮下注射瘤苗应激（抗原液加PBS共2 mL），2周后（共5次）进行肿瘤荷瘤造模。对照组小鼠每3天接受1次皮下注射2 mL的PBS，同样2周后行荷瘤造模。
1.3.3 A549皮下移植造模及肿瘤测量 获得复苏后3～4代A549细胞，调整细胞密度为1×106接种小鼠上肢下方（腋窝下）皮肤，接种后分别于第3、5、7、15、21、30天观察肿瘤增长情况；处死小鼠后，取下肿瘤组织，测量最长径与最短径，计算肿瘤体积，公式为公式V=2πab/6（a为长径，b为短径）。
1.3.4 Western blot检测PCNA、Ki-67蛋白表达 接种后第7、30天，提取细胞总蛋白，紫外分光光度计检测蛋白浓度后将蛋白上样，以堆积胶80 V，分离胶120 V，电泳时间90 min；移入玻璃皿中加入Coomassie染色液2 h后脱色；再转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗孵育，一抗的封闭液稀释为1∶20，同时抗人GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）单克隆抗体作为阳性对照，其封闭液稀释为 1∶1000。室温作用2 h，TBST冲洗5 min×4次；辣根酶标记二抗，封闭液稀释为1∶2000，室温1 h后TBST冲洗；定影、显影。结果用数码相机摄取并用NCBI的Melanie Viewer 7.0软件分析进行图像分析，测定各个条带的灰度值，将SIRTI条带灰度值与其相应的GAPDH条带灰度值相比较，每组所得数值求均数。
1.3.5 Real-time PCR检测PCNA、Ki-67 mRNA表达 接种后第7、30天，提取细胞总RNA提取，所得RNA溶解于DEFC水中；紫外分光光度计测定总RNA浓度 取2 μL总RNA稀释至600 μL，测260处光密度OD值，RNA浓度（μg/mL）=OD×300×40。加入逆转录及PCR扩增反应体系。扩增过程：取2 μL模板，在25 μL PCR扩增反应体系中先将模板于97℃，2 min，加入Taq DNA聚合酶，循环仪中循环35次。PCR扩增条件及引物见表1。反应完成后，取10 μL PCR反应液在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离，EB染色后照相，软件系统扫描。以目的mRNA扩增带的平均光密度对GAPDH mRNA扩增带平均光密度的比值代表组织中目的mRNA的表达水平。
表 1 PCNA、Ki-67和GAPDH的Real-time PCR引物与条件
注：PCNA：增殖细胞核抗原；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MSCs形态
原代接种1 d即可见较多贴壁细胞，外观呈纺锤形和多角形，并可见细胞核，48～72 h后细胞数量明显增多，呈现纤维长条样梭型细胞；图1示不同放大倍数下MSCs的形态，可看到不甚均一的梭型排列的细胞，400倍镜下可见到有部分细胞细胞核内有双核仁。
在倒置显微镜下MSCs多呈纺锤形和多角形，部分细胞呈现纤维长条样梭型细胞，400倍镜下可见部分MSCs的细胞核内有双核仁，提示细胞增殖活跃，细胞状态良好
图1 MSCs倒置显微镜下形态
2.2 移植瘤体积及其增殖曲线评估
分别对两组小鼠的肿瘤进行测量，首先评估体内肿瘤增殖情况，如图2所示，实验组皮下移植肿瘤明显小于对照组；进一步解剖获得肿瘤，分别测量两组肿瘤的最长径与最短径计算出其体积，第3天时，对照组移植瘤的短径及长径均大于实验组，但是差异无统计学意义（P > 0.05），然而自第5天开始，MSCs抗原进行预防接种，实验组其短经与长径都小于对照组（P < 0.05）；第3、5、7、15、21、30天实验组体积均明显小于对照组（P < 0.05或P < 0.01），见表2。并进一步获得其增殖曲线，发现实验组的增殖趋势明显低于对照组。
表2 两组移植瘤直径及体积的比较（x±s）
注：与对照组同期比较，*P < 0.05，**P < 0.01
实验组皮下移植肿瘤明显小于对照组；实验组体积明显小于对照组，增殖趋势明显低于对照组
图2 移植瘤体积及增殖曲线
2.3 MSCs全细胞瘤苗抗原对PCNA及Ki-67的影响
MSCs作用后，肿瘤组织的PCNA及Ki-67的表达都明显下调，本研究检测了7、30 d的PCNA与Ki-67的表达，可见在蛋白水平及mRNA水平PCNA与Ki-67的表达，实验组显著低于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表3、图3～4。
表3 两组PCNS及Ki-67表达水平比较（x±s）
注：与对照组同期比较，*P < 0.05，**P < 0.01；PCNA：增殖细胞核抗原
与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；PCNA：增殖细胞核抗原；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶
图3 两组PCNA、Ki-67的蛋白表达情况
与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01
图4 两组PCNA、Ki-67的mRNA表达
3 讨论
肿瘤免疫治疗源于Burnet提出的“肿瘤免疫监视”理论，认为机体的免疫系统能够通过细胞免疫机制识别并产生免疫应答。研究表明，该种免疫应答的机制十分复杂，涉及多种免疫细胞及其分泌的产物，包括T淋巴细胞、NK细胞、NC细胞和巨噬细胞等免疫细胞介导的特异或非特异的细胞免疫，抗体介导的体液免疫以及补体、细胞因子的抗肿瘤作用[6]；因此，探索有效、安全的应激源即“识别”是免疫治疗的基础[7]。
肿瘤的胚胎特性的认识由来已久，并且二者在增殖分化、侵袭、血管侵蚀和新生血管形成、免疫逃逸及细胞凋亡等诸多方面具有惊人的相似性[8]：二者表达相同的表面抗原，即癌胚抗原（carcino-embryonic antigens，CEA），在肿瘤状态时会使得机体一些机体发育过程中许多原本“关闭”的基因激活，可重新生成和分泌这些胚胎期的蛋白如甲胎蛋白、CEA、FSA等[9-10]。正是基于此，研究者开始探索干细胞与肿瘤的关系。大量研究，在多种实体肿瘤中都存在少数具有干细胞特性即自我更新能力和多向分化潜能的细胞亚群，这种细胞亚群被称为肿瘤干细胞，其对肿瘤形成、复发、转移及化疗耐药性都有着重要影响[11]。2009年，Li等[4]创新性地发现以胚胎干细胞体外制作瘤苗可以起到抑制肿瘤增殖的作用，这项研究也使得人们在瘤苗探索的道路上多了新的思路，即干细胞可以作为瘤苗来源。那么，除了胚胎干细胞别的干细胞是否具有类似的作用呢？
本研究首次评估了MSCs作为瘤苗具有肿瘤免疫接种作用。笔者以X线照射MSCs获得裂解抗原，每周3 d一次给予BALB/c小鼠皮下接种，连续4周获得瘤苗应激模型；再以GFP-A549皮下注射对其进行荷瘤造模，并设置第3、5、7、15、21、30天观察肿瘤增殖情况，本研究发现瘤苗接种组从第3天开始其肿瘤体积小于对照组，并且随着时间的延长，其差别愈发明显，说明疫苗应激产生的抑瘤作用可能是长期的。Li等[4]采用胚胎干细胞系H9获得疫苗，观察其免疫刺激后荷瘤的增殖情况，同样发现自第3天开始其免疫应激的抑瘤作用开始凸显；又有学者比较胚胎干细胞瘤苗对于不同数量的腺瘤细胞移植后肿瘤增殖的影响，发现无论移植初始细胞计量多少，干细胞瘤苗均可以产生明确的抑瘤作用[12]。
PCNA由Miyachi等[13]于1978年在系统性红斑狼疮患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名；Mathews等[14]发现PCNA与细胞周期蛋白（Cyclin）属于同一物质，并与细胞增殖程度直接相关；后来人们在乳腺癌、肺癌、肝癌、大肠癌等多种肿瘤中都监测到PCNA表达的上调[15-16]；总之，在不同的调控通路中，PCNA可以作为多种蛋白的功能转换因子发挥作用。在细胞增殖、分化及凋亡事件中，PCNA都参与了十分重要的角色，尤其是反映细胞增殖状态的良好指标。Ki-67是一种大分子蛋白质，存在于细胞核内，1993年，学者得出其氨基酸序列[17]，发现其包含有40个弱的和10个强的PCST区（富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸）；研究显示，Ki-67与细胞增殖至关重要，可以用来识别生长中的正常和肿瘤细胞，评估细胞的增殖程度，但对静止期的细胞无作用，故Ki-67已成为细胞增殖的标志之一；研究者发现Ki-67的作用是在有丝分裂过程中有维持DNA规则结构的重要作用，是具有结合特性的重要的结构蛋白，在细胞增殖过程中不可缺少[18]；研究已经证实其在乳腺癌[19]、肺癌[20]、结直肠癌[21]等几乎所有的恶性增殖的肿瘤中都高表达。
因此，为了初步评估MSCs瘤苗用于A549的接种的分子机制，本研究检测了第7、30天接种组和对照组肿瘤增值因子PCNA及Ki-67的蛋白及mRNA表达情况。正如本研究结果中描述的一样，瘤苗应激刺激后无论蛋白水平和RNA水平，PCNA及Ki-67的表达都显著下调，从而推测，瘤苗可能由于免疫状态的改变下调了抑制瘤的增殖活性，从而抑制了移植瘤的增殖。当然，细胞的免疫通路纷繁复杂，其内在的具体的分子通路及免疫机制有待进一步深入研究。
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（收稿日期：2014-04-15 本文编辑：任 念）