柔毛鸦胆子茎的化学成分及其肿瘤细胞毒活性研究

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[摘要]运用各种柱色谱方法和制备型HPLC技术对柔毛鸦胆子茎的化学成分进行分离纯化，共从其茎的95%乙醇提取物中分离得到10个化合物，采用NMR等波谱技术鉴定其结构分别为deacetylated isobrucein B（1），indaquassin X（2）， cleomiscosin A（3），cleomiscosin B（4），（+）-lyoniresinol（5），（+）-表松脂醇（6），（+）-松脂醇（7），（+）-丁香脂素（8），4，5-dihydroblumenol A（9），腺苷（10）。采用MTT法对以上化合物进行了体外细胞毒活性测试，化合物2对人源肿瘤细胞HT-29，HepG2，BGC-823和SKOV3具有显著的细胞毒活性（IC50 0.84～3.97 μmol·L-1）。所有化合物均为首次从该植物中分离得到，其中化合物1是1个新天然产物。化合物2对人源肿瘤细胞HT-29，HepG2，BGC-823和SKOV3具有显著的细胞毒活性。

[关键词]苦木科；柔毛鸦胆子；化学成分；细胞毒活性

柔毛鸦胆子Brucea mollis系苦木科 Simaroubaceae鸦胆子属Brucea植物，又名大果鸦胆子、毛鸦胆子，产于我国广西、广东、云南及印度和马来西亚等地区，为灌木或小乔木。该属植物全世界有6种，我国只有鸦胆子B. javanica和柔毛鸦胆子2种，主要用于治疗痢疾、疟疾、赘瘤、鸡眼等[1-2]。化学成分研究表明该属植物的主要成分为苦木素类，此外还有少量的生物碱、萜类和苯丙素类等成分；药理活性广泛，具有细胞毒、抗疟、抗炎、抗病毒及降血脂等活性[3]。为了更好的开发利用鸦胆子属资源，对采自广西靖西柔毛鸦胆子的茎进行了系统的化学成分研究，在前期工作基础上[4-5]，又从中分离中分离得到10个化合物，分别鉴定为deacetylated isobrucein B（1），indaquassin X（2），cleomiscosin A（3），cleomiscosin B（4），（+）-lyoniresinol（5），（+）-表松脂醇（6），（+）-松脂醇（7），（+）-丁香脂素（8），4，5-dihydroblumenol A（9），腺苷（10）。以上化合物均为首次从该植物中分离得到，其中化合物1是新天然产物。化合物2对人源肿瘤细胞HT-29，HepG2，BGC-823和SKOV3具有显著的细胞毒活性。

1 材料

Inova 500 FT核磁共振仪，溶剂峰为内标；Agilent 1100 Series LC-MSD-Trap-SL型质谱仪测定ESI-MS；Perkin-Elmer 241旋光仪；LC-6AD岛津液相色谱仪，制备型反相YMC-Pack ODS-A色谱柱（20 mm×250 mm， 10 μm）；反相Rp-C18 （25～40 μm） 材料由日本Fuji Silysia公司生产；SephadexTM LH-20为瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB生产；大孔树脂 Diaion HP-20为北京绿百草科技公司生产；柱色谱硅胶（160～200目）和薄层色谱硅胶GF254均为青岛海洋化工厂产品。

实验药材于2009年7月采于广西省靖西县，由广西中医学院韦松基教授鉴定为柔毛鸦胆子B. mollis的茎，标本存放于中国医学科学院药物研究所标本室（No.ID-21977）。

2 提取分离

干燥的柔毛鸦胆子茎（6.5 kg） 粉碎后用95%乙醇回流提取3次，每次2 h。提取液减压浓缩成浸膏后将其悬浮于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得60，82，102 g。乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇（70∶1～1∶1） 梯度洗脱，得到6个组分（Fr.1～Fr.6）。Fr.1先经硅胶柱色谱以石油醚～乙酸乙酯（2∶1～1∶1）反复纯化，得3个流分Fr.1a～Fr.1c。Fr.1a经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇洗脱）纯化，再经制备液相色谱（45%乙腈， 5 mL·min-1） 得化合物3（20 mg，tR 26 min），4（26 mg，tR 32 min）。Fr.1b经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇洗脱）分离纯化，得化合物5（8 mg），6（6 mg）。Fr.1c经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇洗脱）分离纯化，得化合物7（40 mg），8（3 mg），9（15 mg）。Fr.2先经中压制备液相色谱以甲醇～水（20%～90%）梯度洗脱，得5个流分Fr.2a～Fr.2e。Fr.2c经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇洗脱）得到化合物1（36 mg）。正丁醇部位萃取物经Diaion HP-20柱色谱，分别用水，30%，50%，95%乙醇洗脱，得4个组分（Fr.A～Fr.D）。Fr.B先经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇洗脱）分离纯化，得3个流分Fr.B1～Fr.B3。Fr.B3经制备液相色谱（15%乙腈，5 mL·min-1）分离，得化合物2（3 mg，tR 41 min），10（3 mg，tR 17 min）。

3 结构鉴定

化合物1 白色粉末；ESI-MS m/z 439 [M+H] +。1H-NMR（C5D5N，500 MHz） δ：6.09（1H，br s，H-3），6.05（1H，d，J=13.0 Hz， H-15），5.49（1H，d，J=4.5 Hz，H-11），5.10（1H，d，J=7.5 Hz，H-20a），5.03（1H，br s，H-12），4.83（1H，br s，H-7），4.32（1H，s，H-1），3.91（1H，J=7.5 Hz，H-20b），3.76（3H，s，21-OAc），3.58（1H，d，J=12.5 Hz，H-14），3.05（1H，br d，J=12.5 Hz，H-5），2.86（1H，d，J=4.0 Hz，H-9），2.22（1H，br d，J=14.5 Hz， H-6α），1.72（1H，overlapped，H-6β），1.67（3H，s，H-18），1.40（3H，s，H-19）； 13C-NMR（C5D5N，125 MHz） δ：198.4（C-2），173.6（21-OAc），172.7（C-16），163.0（C-4），125.0（C-3），82.9（C-7），82.5（C-13），76.7（C-12），75.3（C-11），74.0（C-20），66.3（C-15），55.4（-OMe），52.2（C-14），48.3（C-10），46.1（C-8），43.7（C-5），43.2（C-9），28.5（C-6），22.1（C-18），11.3（C-19）。1H-NMR和13C-NMR数据与文献[6]报道化合物deacetylated isobrucein B基本一致。在NOESY谱中，H-9与H-1，5，15有相关，表明这4个氢均为α构型；H-7与H-14，20β 有相关，H-19与H-20α有相关，表明这4个氢均为β构型。以上NOE相关证实了二者构型一致，故鉴定化合物1的结构为deacetylated isobrucein B，为一新的天然产物。

化合物2 白色粉末；ESI-MS m/z 427 [M+H] +。1H-NMR（C5D5N，500 MHz） δ：6.21（1H，s，H-15），6.20（1H，s，H-3），5.73（1H， s，H-7），5.50（1H，s，H-9），4.99（1H，d，J=7.0 Hz，H-20a），4.60（1H，s，H-1），4.35（1H，d，J=7.0 Hz，H-20b），4.31（1H，s，H-12），4.23（1H，br d，J=11.0 Hz，H-6），3.39（1H，br d，J=11.0 Hz，H-5），2.99（1H，d，J=4.5 Hz，H-9），2.49（3H，s，H-18），2.07（3H，s，H-21），1.62（3H，s，H-19）；13C-NMR（C5D5N，125 MHz） δ：198.3（C-2），174.9（C-16），166.4（C-4），126.9（C-3），84.4（C-7），84.2（C-13），83.4（C-1），82.3（C-14），82.0（C-12），75.6（C-11），70.6（C-20），69.3（C-15），68.1（C-6），51.3（C-8），50.7（C-5），49.1（C-10），44.6（C-9），27.1（C-18），19.4（C-21），12.6（C-19）。以上数据与文献[7]数据一致，故鉴定为indaquassin X。

化合物3 白色粉末；ESI-MS m/z 439 [M+Na] +。1H-NMR（C5D5N，500 MHz） δ：7.75（1H，d，J=9.5 Hz，H-4），7.19（2H，s，H-2′，6′），6.73（1H，s，H-5），6.45（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），5.59（1H， d，J=8.5 Hz，H-7′），4.50（1H，d，J=8.0 Hz，H-8′），4.33（1H，d，J=13.5 Hz， H-9a），3.93（1H，d，J=13.5 Hz，H-9b），3.79（3H，s，-OMe），3.76（6H，s，-OMe×2）；13C-NMR（C5D5N，125 MHz） δ：160.8（C-2），149.3（C-3′，C-5′），146.4（C-6），144.5（C-4），139.4（C-9），138.5（C-7），138.4（C-4′），133.1（C-8），126.5（C-1′），113.9（C-3），111.9（C-10），106.4（C-2′，C-6′），101.1（C-5），79.9（C-8′），77.9（C-7′），60.8（C-9′），56.3（-OMe×2），56.2（-OMe）。以上数据与文献[8]数据一致，故鉴定为cleomiscosin A。

化合物4 白色粉末；ESI-MS m/z 387 [M+H] +。1H-NMR（C5D5N，500 MHz） δ：7.73（1H，d，J=9.5 Hz，H-4），7.40（1H， s，H-2′），7.34（1H，d，J=8.0 Hz，H-6′），7.28（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.43（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），6.71（1H，s，H-5），5.57（1H，d，J=8.5 Hz，H-7′），4.46（1H，d，J=8.0 Hz，H-8′），4.30（1H，d，J=12.5 Hz，H-9′a），3.90（1H，dd，J=12.5，2.5 Hz，H-9′b），3.77（3H，s，-OMe），3.69（3H，s，-OMe）；13C-NMR（C5D5N，125 MHz） δ：161.0（C-2），149.6（C-3′），149.1（C-4′），146.6（C-6），144.7（C-4），139.6（C-9），138.6（C-7），133.3（C-8），127.8（C-1′），121.9（C-6′），114.1（C-3），112.5（C-2′），112.1（C-10），101.3（C-5），80.1（C-8′），77.8（C-7′），60.9（C-9′），56.4（-OMe），56.0（-OMe）。以上数据与文献[8]数据一致，故鉴定为cleomiscosin B。

化合物5 白色粉末；ESI-MS m/z 443 [M+Na]+。1H-NMR（Me2CO-d6，500 MHz） δ：6.55（1H，s，H-2′），6.41（2H，s，H-2，H-6），4.25（1H，d，J=7.0 Hz，H-7），3.87（1H，m，H-9a），3.81（3H，s，-OMe），3.71（6H，s，-OMe×2），3.66（1H，m，H-9b），3.50（1H，m，H-9），3.34（3H，s，-OMe），2.62（2H，m，H-7′），1.95（1H，m，H-8），1.63（1H，m，H-8′）；13C-NMR（Me2CO-d6，125 MHz） δ：147.7（C-3，5），147.0（C-3′），146.6（C-5′），137.8（C-1），137.3（C-4′），134.8（C-4），128.8（C-1′），125.1（C-6′），107.0（C-2′），106.5（C-2，6），64.9（C-9′），62.7（C-9），59.2（-OMe），56.4（-OMe×2），55.9（-OMe），46.8（C-8），40.4（C-7），39.3（C-8′），32.3（C-7′）。以上数据与文献[9]数据一致，故鉴定为（+）-lyoniresinol。

化合物6 白色粉末；[α]20D+78（c 0.05，MeOH）；ESI-MS m/z 381 [M+Na] +。1H-NMR（Me2CO-d6，500 MHz） δ：6.99（1H，br s，H-2），6.98（1H，br s，H-2′），6.83（1H，d，J=8.0 Hz，H-6），6.80（2H，overlapped，H-5，5′），6.77（1H，d，J=8.0 Hz，H-6′），4.82（1H，d，J=6.0 Hz，H-7），4.35（1H，d，J=6.0 Hz，H-7′），4.01（1H，d，J=9.0 Hz，H-9a），3.84（6H， s，-OMe×2），3.79（1H，overlapped，H-9′a），3.75（2H，t，J=8.5 Hz，H-9b），3.39（1H，m，H-8），3.21（2H，t，J=8.5 Hz，H-9′b），2.88（1H，m，H-8′）；13C-NMR（Me2CO-d6，125 MHz） δ：148.2（C-3），148.0（C-3′），146.9（C-4），146.3（C-4′），134.3（C-1），131.3（C-1′），119.6（C-6），119.0（C-6′），115.4（C-5，5′），110.4（C-2），110.1（C-2′），88.5（C-7），82.6（C-7′），71.4（C-9），70.0（C-9′），55.6（C-8，-OMe），55.0（-OMe），50.2（C-8′）。以上数据与文献[10]数据一致，故鉴定为表松脂醇。

化合物7 白色粉末；ESI-MS m/z 359 [M+H] +。1H-NMR（Me2CO-d6，500 MHz） δ：6.98（2H，d，J=2.0 Hz，H-2，2′），6.83（2H，dd，J=8.0，1.5 Hz，H-5，5′），6.78（2H，d，J=8.0 Hz，H-6，6′），4.66（2H，d，J=4.0 Hz，H-7，7′），4.20（2H，m，H-9a，9′a），3.83（6H，s，-OMe×2），3.80（2H，m，H-9b，9′b），3.08（2H，m，H-8，8′）；13C-NMR（Me2CO-d6，125 MHz） δ：148.2（C-3，3′），146.8（C-4，4′），134.1（C-1，1′），119.5（C-6，6′），115.5（C-5，5′），110.5（C-2，2′），86.6（C-7，7′），72.1（C-9，9′），56.2（-OMe×2）， 55.2（C-8，8′）。以上数据与文献[11]数据一致，故鉴定为（+）-松脂醇。

化合物8 白色粉末；ESI-MS m/z 419 [M+H] +。1H-NMR（Me2CO-d6，500 MHz） δ：6.67（4H，s，H-2，6，2′，6′），4.66（2H，d，J=3.5 Hz，H-7，7′），3.83（4H，m，H-9，9′），3.82（12H，-OMe×2），3.08（2H，m，H-8，8′）；13C-NMR（Me2CO-d6，125 MHz） δ：148.6（C-3，3′，5，5′），136.1（C-4，4′），133.2（C-1，1′），104.4（C-2，2′，6，6′），86.7（C-7，7′），72.3（C-9，9′），56.6（-OMe×4），55.3（C-8，8′）。以上数据与文献[12]数据一致，故鉴定为（+）-丁香脂素。

化合物9 无色油状液体；ESI-MS m/z 225 [M+H]+。1H-NMR（C5D5N，500 MHz） δ：6.33（1H，dd，J=15.5，5.5 Hz，H-7），6.21（1H，d，J=15.5 Hz，H-8），6.06（1H，s，H-4），4.67（1H，br s，H-9），2.68（1H， d，J=16.5 Hz，H-2a），2.39（1H，d，J=16.5 Hz，H-2b），1.97（3H，s，Me），1.42（1H，d，J=6.0 Hz，H-10），1.24（3H，s，-Me），1.10（3H，s，-Me）；13C-NMR（C5D5N，125 MHz） δ：197.8（C-3），164.6（C-5），137.3（C-7），129.3（C-8），126.6（C-4），78.9（C-6），67.4（C-9），50.3（C-2），41.6（C-1），24.5（-Me），24.4（-Me），19.4（-Me）。以上数据与文献[13]数据一致，故鉴定为4，5-dihydroblumenol A。

化合物10 黄色粉末；ESI-MS m/z 268 [M+H]+。1H-NMR（C5D5N，500 MHz） δ：8.60（1H，s，H-2），8.35（1H，s，H-8），6.71（1H，d，J=5.5 Hz，H-1′），5.50（1H，t，J=2.5 Hz，H-4′），5.05（1H，br s，H-2′），4.75（1H，d，J=2.5 Hz，H-4′），4.31（1H，d，J=12.5 Hz，H-5′a），4.13（1H，d，J=12.5 Hz，H-5′b）；13C-NMR（C5D5N，125 MHz） δ：157.4（C-6），153.0（C-2），149.3（C-4），140.3（C-8），121.3（C-5），90.6（C-1′），87.6（C-4′），75.3（C-3′），72.2（C-2′），62.8（C-5′）。以上数据与文献[14]报道化合物一致，故确定其结构为腺苷。

4 生物活性

采用MTT法，对化合物1～8进行了肿瘤细胞毒活性评价，实验结果发现苦木素类化合物2对所筛选的5种人源肿瘤细胞株（HT-29，HepG2，BGC-823，SKOV3和A549）中HT-29，HepG2，BGC-823和SKOV3具有显著的细胞毒活性，其IC50分别为2.25，3.97，3.63，0.84 μmol·L-1。其余化合物对所筛选的5种肿瘤细胞均无明显的细胞毒活性（IC50 > 10 μmol·L-1）。化合物1，2均为苦木素类成分，该类成分多具有显著的细胞毒活性。已有的构效关系表明[15]，A环中α，β-不饱和内酯酮为其活性必须基团，C环含氧桥的存在可增强其活性并能增加对实体瘤的选择性。化合物1和2结构中A环和C环虽满足以上要求，但活性差异显著，说明C环13位上甲酯侧链还原为甲基，C-6和C-14被羟基取代可增强其对HT-29，HepG2，BGC-823和SKOV3肿瘤细胞的细胞毒性。

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Chemical constituents from stems of Brucea mollis and their cytotoxic activity

CHEN Hui1，2， BAI Jian1， FANG Zhen-feng1， MA Shuang-gang1， YU Shi-shan1*， CHEN Xiao-guang1

（1.State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Institute of Materia Medica，

Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100050， China；

2. School of pharmacy， Henan University of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450046， China）

[Abstract] Ten compounds were isolated from the stems of Brucea mollis by various chromatographic techniques such as column chromatography on silica gel and Sephadex LH-20， and preparative HPLC， and their structures were elucidated as deacetylated isobrucein B（1）， indaquassin X（2）， cleomiscosin A（3）， cleomiscosin B （4），（+）-lyoniresinol（5）， （+）-epipinoresinol（6）， （+）-pinoresinol（7），（+）-syringaresinol（8）， 4，5-dihydroblumenol A（9） and adenosine（10） on the basis of spectroscopic data analysiS.All compounds were obtained from this plant for the first time， moreover， compound 1 was a new natural product. Compound 2 showed significant cytotoxic activities against the human cell lines HT-29， HepG2， BGC-823 and SKOV3 with IC50 values of 0.84-3.97 μmol·L-1.

[Key words] Simaroubaceae； Brucea mollis； chemical constituents； cytotoxic activity

doi：10.4268/cjcmm20131421