拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLV1胞外域的可溶性表达与纯化

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摘要：大肠杆菌ＮｕｓＡ蛋白与拟南芥ＬＲＲ－ＲＬＫ家族蛋白ＣＬＡＶＡＴＡ１（ＣＬＶ１）胞外结构域（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ， ＥＣＤ）融合表达，实现了蛋白ＣＬＶ１－ＥＣＤ的可溶性表达；ＣＬＶ１-ECD与其配体蛋白ＣＬＡＶＡＴＡ３（ＣＬＶ３）共表达，可以明显提高它的水溶性。该实验方法快速简易地获得了大量纯化的ＣＬＶ１－ＥＣＤ蛋白，避免了包涵体变性与复性的复杂过程，为植物ＣＬＡＶＡＴＡ信号系统的进一步研究奠定了基础。

关键词：亮氨酸重复序列；ＣＬＡＶＡＴＡ１（ＣＬＶ１）；可溶性表达；胞外结构域；共表达

中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2259-04

Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＲＲ－ＲＬＫ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＬＶ１ Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ

ＬＩ Ｆｅｎｇ，ＹＡＮ Ｘｉａｏ－ｊｉｎ，ＨＡＮ Ｃｕｉ－ｘｉａｏ，ＦＥＮG Ｄｕｏ，ＬＩ Ｑｉａｎ－ｑｉａｎ，ＧＡＯ Ｗｅｉ

（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｔｒｅｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ / Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＬＲＲ－ＲＬＫ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＬＡＶＡＴＡ１ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ （ＣＬＶ１－ＥＣＤ） ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ＮｕｓＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｔｈｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＬＶ１－ＥＣＤ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＬＡＶＡＴＡ３（ＣＬＶ３） ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＣＬＶ１－ＥＣＤ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ａｖｏｉｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ′ｓ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ could ｏｂｔａｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ for ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ＣＬＡＶＡＴＡ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（ＬＲＲ）； ＣＬＡＶＡＴＡ１（ＣＬＶ１）； ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ； ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

植物体茎端分生组织（Ｓｈｏｏｔ ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍ，ＳＡＭ）是植物体胚后发育所有地上部分（Ａｅｒｉａｌ ｐａｒｔｓ）器官发生的源泉，高等植物最终形态主要依赖于ＳＡＭ发育调控［１］。ＳＡＭ的干细胞分化与分裂之间的平衡由ＣＬＡＶＡＴＡ基因与ＷＵＳＣＨＥＬ（ＷＵＳ）组成的负反馈调节环控制［２］。ＣＬＡＶＡＴＡ基因（ＣＬＶ１，ＣＬＶ２，ＣＬＶ３）通过抑制转录因子ＷＵＳ的表达来限制干细胞的数目，促进干细胞的分化，而ＷＵＳ转录因子的表达可促进ＣＬＶ３基因的表达，从而维持干细胞特性［３－５］。

ＣＬＶ１基因编码一个由９８０个氨基酸组成的１０５ ｋｕ的膜蛋白，该蛋白具有３个结构域，即由２１个亮氨酸重复序列（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ，ＬＲＲ）组成的胞外结构域（Ectodomain，ECD）、单次跨膜区和一个胞内ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ激酶区组成，属于富亮氨酸重复的类受体蛋白激酶（ＬＲＲ－ＲＬＫ）家族。最近日本研究人员利用光亲和标记（Ｐｈｏｔｏ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ）技术证明了多肽信号ＣＬＶ３是直接与ＣＬＶ１的胞外结构域（clv1-ECD）结合的，而胞内激酶区对多肽信号的结合力没有影响［６］。CLV1-ECD共有６１５个氨基酸，由２１个ＬＲＲ基序组成，疏水氨基酸占到了４６．５％，其中有９３个亮氨酸和４５个异亮氨酸。Ｗｉｋｉｎｓｏｎ等［７］和Ｓｍｉａｌｏｗｓｋｉ等［８］的研究表明蛋白质异源表达的可溶性与氨基酸的组成有很大关系，而亮（异亮）氨酸含有较长的疏水性脂肪族侧链基团，在水中的溶解度极小。因此该类蛋白在原核表达过程中常常形成包涵体，不利于下一步结构与功能的研究。

本实验拟用载体质粒ｐＥＴ４４ａ携带的大肠杆菌ＮｕｓＡ蛋白与拟南芥ＣＬＶ１-ECD融合表达，实现ＣＬＶ１－ＥＣＤ的可溶性表达，经亲和层析纯化可得到纯度较高的融合蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ。在两种抗生素的选择压力下，使两个不相容的质粒（ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３）在大肠杆菌中稳定存在并实现外源蛋白ＣＬＶ１－ＥＣＤ与其配体蛋白ＣＬＶ３共表达，进一步提高其水溶性。本研究是首次报道拟南芥ＣＬＶ１的胞外结构域在大肠杆菌表达体系中的可溶性表达，可为研究植物ＣＬＡＶＡＴＡ信号通路的分子机理奠定生化基础。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１细胞、菌株和质粒大肠杆菌感受态细胞ＤＨ５α及ＢＬ２１（ＤＥ３）和质粒载体ｐＥＴ４４ａ均为本实验室保存；质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ａｔＣＬＶ１和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３为中国科学院植物研究所刘春明研究员提供。

１．１．２主要仪器与试剂ＦａｓｔＰｆｕ聚合酶购自Ｔｒａｎｓｇｅｎ公司；Ｘｈｏ Ｉ，Ｂａｍ ＨＩ，Ｔ４ ＤＮＡ连接酶和蛋白质分子量标准购自美国ＮＥＢ公司；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ为广州东盛生物科技有限公司产品；ＩＰＴＧ、氨苄青霉素和卡那霉素购自德国Ｍｅｒｃｋ公司；ＤＮＡ凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Ｎｉ－ＮＴＡ树脂购自瑞典ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；核酸电泳仪和蛋白质电泳仪为美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

１．２方法

１．２．１拟南芥ＣＬＶ１－ＥＣＤ的ＰＣＲ扩增根据ＮＣＢＩ公布的拟南芥ＣＬＶ１基因序列设计上下游引物扩增其胞外结构域片段ＣＬＶ１－ＥＣＤ（７３－１ ９１４ ｂｐ）。引物序列如下：ＦＰ： ５′ＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧ

ＡＧＴＴＣＴ ３′（下划线为Ｂａｍ ＨＩ酶切位点）；ＲＰ： ５′ＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣ ３′（下划线为Ｘｈｏ Ｉ酶切位点）。以质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ａｔＣＬＶ１为模板，进行ＰＣＲ扩增。扩增体系为：模板质粒ＤＮＡ ０．１ μｇ，１０× Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ １．６ μＬ，正反向引物各４ μｍｏｌ，ＦａｓｔＰｆｕ聚合酶０．２ μＬ，加去离子水至２０ μＬ。反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５５ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃后延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ反应产物进行１．０％琼脂糖凝胶电泳，目的条带用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收。

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１．２．２ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ重组质粒的构建上述纯化后的ＰＣＲ产物ＣＬＶ１－ＥＣＤ以及表达载体ｐＥＴ４４ａ质粒用Ｂａｍ ＨＩ和Ｘｈｏ Ｉ双酶切，分别回收后用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶１６ ℃过夜连接。连接产物转化ＤＨ５α感受态细胞，涂布含１００ μｇ／ｍＬ氨苄青霉素的固体ＬＢ平板，３７ ℃培养箱倒置过夜培养后随机挑取单菌落，做菌落ＰＣＲ。取菌落ＰＣＲ呈阳性的重组子，提取质粒ＤＮＡ，并用Ｂａｍ ＨＩ和Ｘｈｏ Ｉ双酶切进一步鉴定。将鉴定正确的重组质粒送往北京华大基因研究中心测序。

１．２．３ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ重组蛋白的表达、可溶性分析和纯化把重组质粒ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ转化表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，挑取单克隆菌落接种于含１００ μｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中，３７ ℃振荡培养至ＯＤ６００nm约为０．６时，取出５００ μＬ菌液作对照后加入ＩＰＴＧ至终浓度为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，３７ ℃诱导表达３ ｈ，收集菌体。取出５００ μＬ菌液，用１２％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定表达情况。

将５００ ｍＬ诱导过的菌液用大容量低温离心机离心收集菌体，然后用３０ ｍＬ裂解液（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ值８．０，３００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）重悬菌体，并加入ＰＭＳＦ至终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ，冰浴超声破碎。将菌体裂解液在高速冷冻离心机上，１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４ ℃离心３０ ｍｉｎ后，分别取上清和沉淀，用１２％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定ＣＬＶ１－ＥＣＤ融合蛋白的可溶性。取上清加入预平衡好的亲和树脂，用Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ冲洗层析柱，然后用Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ洗脱目的蛋白。纯化的蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测其纯度。在酶解反应液（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ值８．４，２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２）中，用蛋白酶Ｔｈｒｏｍｂｉｎ切除重组融合蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ的ＮｕｓＡ标签。

１．２．５ＣＬＶ１－ＥＣＤ与其配体蛋白ＣＬＶ３共表达分别取构建成功的表达质粒ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３各２ μＬ，将其混合均匀，然后用热激法转化ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，并将菌液涂布在含有３０ μｇ／ｍＬ卡那霉素和５０ μｇ／ｍＬ氨苄青霉素双重抗性的ＬＢ固体培养基平板上，３７ ℃倒置过夜培养。次日，挑取阳性菌落于含有５０ μｇ／ｍＬ卡那霉素和１００ μｇ／ｍＬ氨苄青霉素双重抗性的ＬＢ液体培养基中３７ ℃过夜培养并提取质粒ＤＮＡ。由于表达质粒ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３中都有一个Ｘｈｏ Ｉ酶切位点，所以用Ｘｈｏ Ｉ把质粒切成线状，用来鉴定共转成功的菌落。剩余的菌液用终浓度为０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ在１６ ℃条件下诱导表达。取样进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，对比共表达与单独表达上清中ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ的含量。用Ｎｉ－ＮＴＡ树脂纯化共表达产物。

２结果

２．１ＰＣＲ扩增产物ＣＬＶ１－ＥＣＤ及ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ重组质粒的鉴定

拟南芥ＣＬＶ１－ＥＣＤ的ＰＣＲ扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳，结果显示其片段大小与预期的１ 842 ｂｐ相符（图１）。ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ重组质粒用Ｂａｍ ＨＩ／Ｘｈｏ Ｉ双酶切得到的两条条带与预期相符（图２）。

２．２重组蛋白的原核表达与纯化

带有Ｈｉｓ标签的重组蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ理论相对分子质量应为１３０ ｋｕ。利用Ｈｉｓ标签与Ｎｉ＋螯合原理，纯化得到了重组蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ（图３）。在酶解缓冲液中，适量的蛋白酶Ｔｈｒｏｍｂｉｎ与融合蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ酶切反应，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明蛋白酶可以切除ＮｕｓＡ标签并得到蛋白样品ＣＬＶ１－ＥＣＤ（图４）。

２．３ＣＬＶ１－ＥＣＤ与其配体蛋白ＣＬＶ３共表达

提取共转菌落的质粒用ＸｈｏⅠ单酶切，琼脂糖凝胶检测出现两条线性的ＤＮＡ片段（９ ０００ ｂｐ和

７ ４００ ｂｐ），与预期结果相符（图５）。重组质粒ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３的表达产物为融合蛋白ＴＲＸ－ＣＬＶ３，分子量为２０ ｋｕ。分别取等量诱导后的菌液和诱导前的菌液，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示诱导组中出现两条蛋白条带（即１３０ ｋｕ和２０ ｋｕ的蛋白条带），而单独表达仅出现一条１３０ ｋｕ或２０ ｋｕ的蛋白条带（图６）。将菌体裂解液高速离心后，取上清和沉淀，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示共表达上清中的ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ量明显比单独表达上清中的量高，表明受体蛋白ＣＬＶ１－ＥＣＤ与其配体蛋白ＣＬＶ３的共表达可以提高ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ的可溶性（图７）。共表达产物利用Ｎｉ－ＮＴＡ树脂纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示两条蛋白条带，分别为蛋白ＮｕｓＡ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ与ＴＲＸ－ＣＬＶ３（图８）。

３讨论

ＮｕｓＡ蛋白是大肠杆菌的蛋白－转录抗终止因子，分子量为５５ ｋｕ，能显著提高与其融合表达的目标蛋白水溶性。如人白介素－３单独表达或与硫氧还蛋白融合表达［１２］时都是包涵体形式的蛋白，而含有ＮｕｓＡ标签的人白介素－３融合蛋白在３７ ℃条件下诱导表达几乎全部可溶（９７％）［１１］。本实验利用ＣＬＶ１－ＥＣＤ与ＮｕｓＡ融合表达，实现了ＣＬＶ１－ＥＣＤ的可溶性表达。

复制子相同的质粒在宿主菌内存在不相容现象，在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，很快导致两种质粒拷贝数失衡，几代后其中一种质粒就可能丢失，不能在同一大肠杆菌共存［１３］。已有研究报道利用两种抗生素的选择压力，可以使两个不相容的质粒在大肠杆菌中稳定存在并表达外源蛋白［１４］。本实验利用氨苄青霉素抗性质粒ｐＥＴ４４ａ和卡那霉素抗性质粒ｐＥＴ４８ｂ分别构建原核表达质粒ｐＥＴ４４ａ－ＣＬＶ１－ＥＣＤ和ｐＥＴ４８ｂ－ＣＬＶ３，在氨苄青霉素和卡那霉素双重选择压力下，两种质粒能够在ＢＬ２１（ＤＥ３）中稳定共存并可以共表达蛋白。由于受体与配体的特异性结合与相互作用，不仅可以促进目的蛋白ＣＬＶ１－ＥＣＤ在大肠杆菌表达体系中能尽可能正确的折叠，同时还可以隐藏一些疏水氨基酸，使其不暴露在蛋白的外部，从而提高了ＣＬＶ１－ＥＣＤ蛋白的可溶性。

该研究成功实现了ＣＬＶ１－ＥＣＤ在大肠杆菌高效可溶表达，并且可以快速制备大量纯化的ＣＬＶ１－ＥＣＤ蛋白，为研究该结构域的功能打下了基础。同时该研究提到的提高外源蛋白在原核表达体系中可溶性表达的方法，为同类问题的解决提供了一个新的思路。

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