怎样鉴别种子所需要的绿色菌肥

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摘 要：通过实验验证，样品复合肥中微生物活性较高，有利于改善土壤状况，增产显著的肥料。而且微生物来源方便，菌种廉价，具有大力开发利用以及推广的重要价值及意义。建议根据实际情况，利用分离纯化的优良菌种进行配方，产出高质量的生物菌肥，为解决化肥对土壤造成的伤害具有重大意义。

关键词：种子；绿色菌肥；鉴别

中图分类号：S144 文献标识码：A

1 概述

1.1 菌肥的含义

微生物肥料又称菌肥、接种剂，是一种以微生物活动作为得到肥料效应的微生物制剂。确切地说，生物肥料是菌而不是肥，因为它本身并不含有植物生长发育需要的营养元素，而只是含有大量的微生物，在土壤中通过微生物的生命活动，改善作物的营养条件。现今，微生物肥料的发展已由单一菌种、单一功能向复合菌种、多功能方向发展[1]。生物复合菌肥是一类由固氮细菌、钾细菌和磷细菌制备而成的复合菌肥。固氮细菌的生理作用是固定空气中游离的氮气，满足农作物对氮肥的需要并且产生生长刺激物质及阻止病原体入侵[2]。

菌肥中的微生物，无论在其发酵过程（可理解为微生物的自身繁殖过程），还是在土壤内的生命活动过程中，均会产生大量的赤霉素和细胞激素类等物质，这些物质在植物根系接触后，会调节作物的新陈代谢刺激作物的生长，从而使作物产生增产效果。菌肥中在植物根系大量生长、繁殖，从而形成优势菌群，这样就抑制和减少了病原的入侵和繁殖机会，起到了减轻作物病害的功效，刺激有机质释放营养。丰富的有机质通过微生物活动后，可不断释放出植物生长所需要的营养元素，达到肥效持久的目的。菌肥松土保肥、改善环境。丰富的有机质还可以改善土壤物理性状，增加土壤团粒结构，从而使土壤疏松，减少土壤板结，有利于保水、保肥、通气和促进根系发育，为农作物提供适合的微生态生长环境。

1.2 菌肥的应用现状

在过去，在农业生产活动中大量使用化肥。化肥容易削弱庄稼的生产能力，庄稼就和人一样，吃得太饱不仅不利于成长，反而不利于健康。施肥过量对庄稼造成危害的结果主要有两个：一个是容易倒伏，倒伏一旦出现，就必然导致粮食减产；另一个是容易发生病虫害，氮肥施用过多，会使庄稼抗病虫能力减弱，易遭病虫侵染，继而增加消灭病虫害的农药用量，直接威胁了食品的安全性。使用化肥容易加剧环境污染，过多施用的肥料量超过土壤的保持能力时，就会流入周围的水中，形成农业面源污染，造成水体富营养化，导致藻类滋生，继而破坏水环境。据统计，中国每年因不合理施肥造成1000多万t的氮素流失到农田之外，直接经济损失约300亿元。过量的肥料还会渗入20m以内的浅层地下水中，使得地下水硝酸盐含量增加。使用化肥浪费大量紧缺资源，如果能够把浪费掉的化肥节省下来，就会缓解我国的能源紧缺状况。仅在2004年，我国化肥生产消耗了大约1亿t标准煤，超过国家能源消耗比重的5%。此外，我国化肥生产每年消耗的高品位磷矿石超过了1亿t，而磷矿石已经列入国土资源部2010年后紧缺资源之列；化肥生产还消耗了我国72%的硫资源[3]。

使用植物菌肥不仅解决了上述的问题，而且具有自身的特点。生物菌肥由于含有大量的生物菌，通过生物菌的活动，不但可以改善土壤的理化性状，提高土壤有机质的含量，而且具有解钾、释磷、固氮的功能。生物菌肥施入土壤后，生物菌很快增殖，形成群体优势分解土壤中被固定的且植物不能吸收利用的氮、磷、钾，并固定空气中游离的氮，供植物吸收利用。生物菌肥不会对作物产生副作用，生物菌在土壤中的增殖代谢过程中能产生赤霉素及其它活性物质等内源激素，可自身调节生理过程，不会对作物产生副作用。生物菌肥可以促进作物生根、出苗、提早成熟，提高作物的抗逆性，表现出抗病、抗旱、抗倒伏的作用[4]。生物菌肥本身无毒、无残留，且能分解土壤中因长期施用化肥、农药的残留，溶解污水灌溉后的重金属残留，净化环境，是绿色农产品生产中的首选肥料。生物菌肥多以优质草碳为载体，其中草碳含有大量的植物必须的微量元素，这是其他化学肥料所不具备的[5]。

随着化肥的大量使用，其利用率不断降低已是众所周知的事实。这说明，仅靠大量增施化肥来提高作物产量是有限的，更何况还有污染环境等一系列的问题。为此，各国科学家一直在努力探索提高化肥利用率达到平衡施肥、合理施肥以克服其弊端的途径。微生物肥料在解决这方面问题上有独到的作用[6]。所以，根据我国作物种类和土壤条件，采用微生物肥料与化肥配合施用，既能保证增产，又减少了化肥使用量，降低成本，同时还能改善土壤及作物品质，减少污染。

随着人民生活水平的不断提高，尤其是人们对生活质量提高的要求，国内外都在积极发展绿色农业（生态有机农业）来生产安全、无公害的绿色食品[7]。生产绿色食品过程中要求不用或尽量少用（或限量使用）化学肥料、化学农药和其他化学物质。它要求肥料必须：保护和促进施用对象生长和提高品质；不造成施用对象产生和积累有害物质；对生态环境无不良影响。微生物肥料基本符合以上三原则。近年来，我国已用具有特殊功能的菌种制成多种微生物肥料，不但能缓和或减少农产品污染，而且能够改善农产品的品质。

利用微生物的特定功能分解发酵城市生活垃圾及农牧业废弃物而制成微生物肥料，是一条经济可行的有效途径[8]。目前已应用的主要是两种方法，一是将大量的城市生活垃圾作为原料经处理由工厂直接加工成微生物有机复合肥料；二是工厂生产特制微生物肥料供应于堆肥厂，再对各种农牧业物料进行堆制，以加快其发酵过程，缩短堆肥的周期，同时还提高堆肥质量及成熟度。另外，还有将微生物肥料作为土壤净化剂使用。

微生物肥料中有益微生物能产生糖类物质，占土壤有机质的0.1%，与植物粘液、矿物胚体和有机胶体结合在一起，可以改善土壤团粒结构，增强土壤[9]。所以，施用微生物肥料能改善土壤物理性状，有利于提高土壤肥力。

微生物在农业上的作用已逐渐被人们所认识。现国际上已有70多个国家生产、应用和推广微生物肥料，我国目前也有250家企业年产约数十万吨微生物肥料应用于生产[10]。（这虽与同期化肥产量和用量不能相比，但确已开始在农业生产中发挥作用，取得了一定的经济效益和社会效应，已初步形成正规工业化生产阶段。

1.3 菌肥的关键：菌种

东北地区的菌肥市场菌肥种类繁多，对东北地区作物的增产及土壤的改良起到了重要作用，对农业产业结构调整具有积极意义。目前，市场上使用最多的菌肥是哈尔滨海洋奇力生物工程有限公司生产的海洋奇力牌双动力生物菌肥，在东北地区的西瓜、玉米、大豆等生产中都得到了广泛的使用，其增产效果明显，产品收益明显高于化肥等其他肥料。针对这一品牌的独特优势，由此进行对海奇牌双动力菌肥的菌种鉴别分类活动。

2 材料方法

2.1 材料

市售海洋奇力牌双动力生物菌肥。

2.2 试验方法

2.2.1 菌种的分离

2.2.1.1 溶解菌肥

在超净工作台内，取4只1.5mL离心管，首先，加入1颗菌肥，加入1mL无菌水后用移液器反复吹打至菌粒完全溶解，作为原液。另外3只离心管依次编号2、3、4并向其中分别加入900uL无菌水。去100uLL原夜加入到2中，混匀，再取2中100uL加入到3中，混匀，在取100uL加入到4中，混匀，制成梯度菌液备用。

2.2.1.2 LB固体培养基的配置

配制：100mLLB培养基加入1.5g琼脂粉。

抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

倒板：10mL倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10～15min。

保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存。

2.2.1.3 菌种的培养

将配制好的菌液采用平板的方法均匀涂在培养基上。将已接种过的培养基，置37℃培养箱内10～14h。

2.2.1.4 菌种的分离

在培养到一定时间后培养基上长出半菌落，用移液器跳去到LB液体培养基上进行富集培养，在摇床上37℃恒温培养24h。

2.2.2 菌种DNA的分离

2.2.2.1 DNA的提取

取1.5mL菌体培养物于灭菌离心管中，12000r/min离心1min，丢去上清夜，收集菌体。加入400uL裂解液混匀，置于37℃水浴1h。然后加入200uL5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000r/min离心15min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾（3M，pH8.0），-20℃保存1h后，13000r/min离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50uLTE溶液中，置4℃保存备用。

2.2.2.2 DNA的电泳检测

配制1%的胶进行电泳PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸3个基本反应步骤构成。

2.2.2.3 PCR的原料

PCR（50ul）：ddH2O为37.5uL；10x buffer为5uL；MgCl2（25mmol）为3uL；dNTP （10mmol）为1uL；primer 1（10mmol）为1uL；primer 2（10mmol）为1uL；cDNA为1uL；Taq为0.5uL。

2.2.2.4 PCR反应条件

94℃、5min（94℃、30s；55℃、30s；72℃、45s）x30，72℃、5min，4℃保温。

2.2.3 PCR产物的回收、连接、转化大肠杆菌

2.2.3.1 PCR产物的回收

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，采用维特洁公司的DNA GeL Extraction Kit回收目的片断。

在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，放入灭过菌的1.5mL离心管中，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μL体积）。加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混匀后于75℃加热，期间颠倒混匀2～3次，直到凝胶块完全溶化（6～8min）。加入1/2个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混匀；将上个步骤中的混合液转移到2mL DNA制备管中，12000r/min离心1min，弃废液。将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000r/min离心1min，弃废液。将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000r/min离心1min，弃废液。以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，12000r/min离心1min，弃废液。将制备管置回2mL离心管，13000r/min离心2min。将制备管置于灭过菌的1.5mL的离心管中，在制备膜中央加25～30μL Eluent，室温静置1min，13000r/min离心2min洗脱DNA。

2.2.3.2 连接

在离心管内配制10μL反应体系混匀后16℃反应3～16h。反应液直接用于大肠杆菌转化。

2.2.3.3 转化大肠杆菌

活化保存于-80℃冰箱的大肠杆菌DH5α菌种。将大肠杆菌DH5α单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜。取1mL过夜培养物加入50mL LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养至对数生长期（OD600=0.6～0.7）。将菌液冰浴30min，4℃，4000r/min离心10min，弃培养液。用冰上预冷的10mL 0.1M CaCL2悬浮沉淀，冰上放置30min。4℃，4000r/min离心10min，弃上清，再加入2mL预冷的0.1M CaCL2悬浮细胞。加入1mL无菌甘油，混匀后分装于灭过菌的1.5mL离心管中（每管200μL），于-80℃冰箱保存备用。

2.2.3.4 转化大肠杆菌感受态细胞

从-80℃冰箱取出感受态细胞，冰上放置至稍微溶化，将全部连接液加入到200μL感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30min。将离心管放到42℃的孵育器中热激90s。快速将离心管置于冰上2min。将800μL LB液体培养基加入到离心管中，37℃、200r/min振荡培养45min。在含有Amp+抗生素的固体培养基上先涂上40μL X-gal，约30min后涂上40μL 200mg/mL异丙硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）溶液。将振荡培养后的菌体6000r/min离心5min，弃上清液，然后用200μL LB液体培养基将沉淀重悬，将重悬液涂到之前涂有X-gal和IPTG的Amp+抗生素平板上。将涂好的平板室温放置30min，然后将平板倒置于37℃培养箱中过夜培养。

2.2.4 重组克隆载体的鉴定

2.2.4.1 重组克隆载体质粒DNA的提取

待长出菌落后，挑取白色单菌落于5mL LB液体培养基中，并加入5μL Amp+，37℃、180r/min过夜培养。次日，取400μL菌液于1.5mL离心管中，加100μL 80%甘油保存于-80℃冰箱。其余菌液利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。

2.2.4.2 重组克隆载体质粒DNA的PCR检测

以重组质粒DNA为模板，PCR扩增质粒DNA，反应条件和体系同上。PCR反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察目的片段的大小。

2.2.5 重组克隆载体质粒DNA的酶切检测

将重组质粒DNA做限制性内切酶酶切（HindⅢ+BamHⅠ），酶切体系20μL。

将混合液置于37℃反应1h，反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察酶切片段的位置和大小，以判断载体的酶切情况。

2.2.6 测序及序列分析

将PCR和酶切鉴定都正确的重组克隆载体命名为：pMD18-T-7αP，然后将保存菌液送去测序，测序由北京三博远志有限公司完成。测序结果用blast软件对其进行序列同源性分析。

3 结果分析

3.1 基因组DNA的提取

利用琼脂糖凝胶电泳可以检测到提取的DNA，大约1400个bp，三种不同的浓度，检测结果一致。

3.2 PCR扩增

经过PCR扩增，得到大量长度为1400bp的基因序列。

3.3 PCR与酶切验证

综上所述，本研究通过使用菌肥颗粒溶液获取到了菌种并通过了扩大培养等方法对这一菌种部分性质做了鉴定。如从菌液中提取了长度约为1400bp的基因序列然后采用聚合酶链式反进行扩增，之后导入到大肠杆菌序列中，最后进行PCR和双酶切实验。最后用blast的方法确定该菌种可能为4种。

4 结语

通过本次实验可见，样品复合肥中微生物活性较高，有利于改善土壤状况，增产显著的肥料。而且微生物来源方便，菌种廉价，因此，具有大力开发利用以及推广的重要价值及意义。可以根据实际情况，利用分离纯化的优良菌种进行配方，产出高质量的生物菌肥，为解决化肥对土壤造成的伤害具有重大意义。

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作者简介：王莉（1972-），农艺师，吉林省长春市种子管理站工作。