MMP-9和COX-2在肾癌组织中的表达水平及临床意义

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【摘要】 目的 探讨肾癌患者肿瘤组织中基质金属蛋白酶9（mmp-9）及环氧合酶2（cox-2）的表达水平及其临床意义。方法 收集50例肾癌患者术后癌组织及20例肾良性病变手术后的肾组织（均经术后病理及影像学等检查确定），并按相应步骤进行切片，分别采用免疫组织化学PV6000两步法测定肾肿瘤组织中两种肿瘤标记物的表达水平，并进行统计学分析。结果 肾癌患者肿瘤组织中的MMP-9及COX-2水平均较良性对照组染色明显（P＜0.05）。其中肾癌组MMP-9的阳性率为86%，而COX-2在肾癌组中的阳性率为82%，二者表达水平明显呈正相关（r=0.039，P＜0.05）。结论 肾癌组织中MMP-9及COX-2都存在着过度表达，且二者均随肿瘤病理分级的增高而表达进一步强烈，证明二者在肾癌的发生、发展、浸润及转移中发挥重要作用

【关键词】 肾癌；基质金属蛋白酶9；环氧合酶2

肾细胞癌（RCC）是泌尿系统常见肿瘤，在各种泌尿系统肿瘤中其发病率仅次于膀胱癌居第二位，其生物学特征多变，易复发和转移，同时也是全身多发的实质脏器恶性肿瘤之一。其临床早期诊断及治疗一直是医学界研究的热点和难题。近年来，环氧合酶-2（COX-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在RCC发展中的作用日益受到人们的关注。本项研究利用免疫组织化学法对肾癌组织中的COX-2及MMP-9表达进行测定，同时结合肾癌的临床病理等方面特征，探究二者在肾癌发展过程中的作用和意义，旨在为肾癌的早期诊断及分子水平研究提供依据。1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 肾癌组 收集青岛大学医学院附属医院2010年3月至2011年4月间手术切除且经病理诊断为原发性肾癌的手术标本50例，以AJCC（2002版）的TNM分期为标准，其中T1期患者28例，T2期患者15例，T3期患者6例，T4期患者1例；其中男32例，女18例，年龄36-68岁，平均（52.7 8.1）岁。所有患者均排除外伤、严重的感染性疾病或者其他系统疾病。

1.1.2 对照组 肾良性及健康对照组20人，均为我院经检查后确诊者，其中肾结石6人，肾囊肿10人，因外伤行肾部分切者4人（经影像学及实验室检查，最后经手术予以确定）。所有患者均排除心肺、肠胃等重要脏器疾病，肝肾功能试验正常，无肿瘤家族史。所有参选病人均经实验室和物理检查、腹部超声、及螺旋CT等检查诊断。

1.1.3 标本采集 免疫组织化学所需标本均经自青医附院病理科获得，经一名经验丰富的技师4μm切片备用。

1.2 检测方法

1.2.1 仪器及试剂 显微镜为德国Leica 4000B荧光倒置显微镜，一抗分别为兔抗人基质金属蛋白酶9多克隆抗体，兔抗人环氧合酶。

1.2.2 单克隆抗体、磷酸盐缓冲液（PBS），DAB显色试剂盒，PV6000即用型免疫组化染色试剂盒。以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化操作步骤按照说明书进行。

1.2.3 采用PV6000两步法测定组织中COX-2及MMP-9水平：经4μm切片的组织标本脱蜡入水，其操作过程严格按说明书进行。MMP-9判读标准：染色阳性为胞浆内出现棕色和棕黄色，显微镜下组织被染成棕黄色的为阳性（+），其阳性细胞数＜40%；成棕色为阳性（++），其阳性细胞数40%-80%；成深棕色（+++），其阳性细胞数＞80%；组织没有着色为阴性［1］。COX-2判读标准：阳性表达定位于细胞浆，呈浅黄色至深棕色，阳性判定标准依据阳性细胞数和阳性反应强度两项指标，阳性着色数＞10%定位阳性表达，阳性反应强度为浅黄色为弱阳性定位（+）、黄色或者棕黄色为中等阳性定为（++）、棕色或者深棕色定为强阳性定为（+++），无棕黄色或者背景着色一致为阴性［2］。

1.3 统计学方法 检测结果采用SPSS软件处理，组间比较行X2检验，两因素间采用非参数检验的Spearman相关分析，显著性检验均为双侧检验，显著性水平设定为P﹤0.05。2 结 果

2.1 MMP-9及COX-2在肾癌组中的表达水平 二者在肾癌组的表达（见表1），经X2检验可以得出二者在肾癌组检测中的阳性率无统计学差异（P＞0.05）。MMP-9定位于癌细胞膜、胞质、细胞间质和部分肿瘤组织间质中，以肿瘤细胞表达为主，见图1，而COX-2定位于癌细胞膜、胞质内，见图2；其中RCC组中MMP-9的阳性表达率为86%，COX-2的阳性表达率为82%，二者的相关性分析表明其在肾癌组中呈明显正相关（r=0.039，P＜0.05）。

表1 MMP-9及COX-2在肾癌组表达水平情况

COX-2 MMP-9

阳性（例） 阴性（例）

合计

阳性 35 6 41

阴性 8 1 9

合计 43 7 50

2.2 COX-2及MMP-9在肾癌组及对照组中的表达情况比较 对肾癌组及肾良性病变组中COX-2及MMP-9表达进行统计学分析后发现，二者表达水平分别在两组中的差异具有统计学意义（P＜0.05），且两项指标之间的表达水平具有强烈正相关性（r=0.512，P＜0.05）。

2.3 COX-2和MMP-9的表达与临床病理特征的关系 经Spearman相关分析检验后发现，COX-2和MMP-9在RCC中的阳性表达率与肿瘤大小、病理分期和转移情况无明显相关性（P＞0.05），而COX-2及MMP-9与RCC的临床组织学分级分别都有明显相关性（r=0.051，r=0.297），其差异具有统计学意义（P＜0.05）。3 讨 论

肾细胞癌（RCC）是最常见的肾脏恶性肿瘤，发病率约占全身恶性肿瘤的3%，其中又以肾透明细胞癌（Clear renal cell carcinoma，CRCC）为常见。由于肾癌的症状比较隐匿，早期难以发现，临床上20%-35%就诊时已发生转移，预后多不良，并且死亡人数呈逐年上升趋势［3］。

肾癌的生物学行为极为多变，其发病机制及发生、发展的分子生物学基础至今尚不明确。环氧合酶（Cyclooxygenase，COX）是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）转化为前列腺素（prostaglandins，PGs）的限速酶，有COX-1和COX-2两种同工酶，COX-2为诱导型，静息时不表达，当细胞受到各种刺激时迅速合成、表达增加。近年来的研究表明，COX-2与RCC的发生、发展及转移有关［4，5］。Khan等［6］发现肾癌中COX-2的表达水平和肿瘤的分级、分期呈正相关，电镜下COX-2表达在核膜、膜面内质网、高尔基复合体和线粒体膜，提示COX-2可能与肾癌的肿瘤发生、进展及转移有关。本试验中COX-2为胞浆染色，与肾癌组织学分级有关，但与病理分期无相关性，可能是因为本研究中纳入的高分期的肿瘤样本数较少有关。

MMP-9又称明胶酶B，是基质金属蛋白酶家族（MMPs）的重要成员之一，是降解Ⅳ型胶原最主要的酶，在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的侵袭转移密切相关［7］，在肿瘤浸润转移中发挥重要作用［8］。MMP-9已经在多中肿瘤中发现明显表达。有研究表明，MMP-9与多种恶性肿瘤的发展、侵袭转移密切相关。Slaton等［9］运用原位杂交技术对肾透明细胞癌组织进行检测并结合随访资料分析也发现，MMP-9表达与其转移密切相关。另有研究表明，MMP-9的表达和活性，随乳腺癌分级的增加而增高［10］。本研究发现，MMP-9阳性表达水平随RCC组织分级水平的增高而相应增高，二者之间具有正相关(r=0.297，P=0.036)，这与上述研究结论相同。

总之，COX-2和MMP-9的表达与RCC的分化程度、侵袭转移密切相关，二者在RCC中的表达呈正相关关系，在肿瘤的进展过程中可能存在协同作用，联合检测两项指标有利于判断肿瘤恶性程度、进展情况，有利于选择更合适的治疗方案以及有效估计患者预后和生存期，同时可能作为未来肾癌分子靶向治疗新的方向，这些都有待我们进一步去研究和探索。

参考文献

［1］ 杜春辉，廖洪利，田刚，等.银屑病皮损ICAM-l，MMP-9表达的研究［J］.右江医学，2007，35（6）：631-632.

［2］ 盂庆泽，赵守元，高建光，等.膀胱移行细胞癌中COX-2的表达其顶后价值［J］.临床泌尿外科杂志，2005，20(3)：171-173.

［3］ 叶敏，叶章群.肾细胞癌的现代诊治.临床泌尿外科杂志，2003，18（11）：641-643.

［4］ Zeman RK，Zeiberg A，Hayes WS，et al.Helical CT of renal masses： the value of delayed scans.AJR，1996，167：771-776.

［5］ Khan KN，Stanfield KM，Trajkovic D，et al.Expression of cyclooxygenase-2 in canine renal cell carcinoma［J］.Vet Pathol，2001，38(1)：116-119.

［6］ Khan KN，Stanfield KM，Trajkovic D，et al.Expression of cyclooxygenase-2 in canine renal cell carcinoma［J］.Vet Pathol，2001，38(1)：116-119.

［7］ 刘岩，高秀敏，李胜水，等.COX-2和MMP-9在膀胱移行细胞癌中的表达及相关性［J］.河北医药，2009，31（21）：2881-2883.

［8］ 范志强，姜佑三，徐勇，等.PCNA、MMP9和E-cd在膀胱移行上皮癌中表达及意义［J］.天津医药，2005，33（7）：405-407.

［9］ Slaton JW，Inoue K，pemotte P，et al.Expression levels of genes that regulate mataotsis and angiogenesis correlate with advance pathological stage of renal cell carcinoma，AM J Pathol，2001，158(2)：735-743.

［10］ Davies B，Miles DW，Happerefield IC，et al.Activity of type Ⅳ collagenases in benign and malignant breast disease［J］.Br J Cancer，1993，67：1126-1131.