自噬抑制剂3-MA在顺铂诱导骨肉瘤MG63细胞凋亡中的作用

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摘要：目的研究自噬抑制剂3-ma在顺铂诱导骨肉瘤mg63细胞凋亡中的作用及其意义。方法培养人骨肉瘤MG63细胞；运用MTT法检测自噬抑制剂3-MA在顺铂诱导下对骨肉瘤MG63细胞的影响；MDC染色法及流式细胞仪检测自噬抑制剂3-MA在顺铂诱导下对骨肉瘤MG63细胞的影响；流式细胞仪检测自噬抑制剂3-MA在顺铂诱导下对骨肉瘤MG63细胞凋亡的变化。结果通过MTT法发现DDP可引起MG63细胞增殖率下降；与单独应用DDP组相比，3-MA+DDP组引起MG63细胞增殖率明显下降；MDC染色及流式细胞仪检测细胞自噬表达，发现与单独应用DDP组相比，3-MA+DDP组自噬表达水平下降；流式细胞术检测发现与单独应用DDP组相比，3-MA+DDP组细胞凋亡率明显增加。结论在自噬抑制剂3-MA的作用下，骨肉瘤MG63细胞自噬表达水平明显下降，从而促使DDP对骨肉瘤MG63细胞的细胞凋亡明显增加。

关键词：自噬；凋亡；3-甲基腺嘌呤（3-MA）；顺铂（DDP）；骨肉瘤细胞

1实验材料

1.1细胞来源 骨肉瘤MG63细胞购于中科院上海细胞库。

1.2主要试剂 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、单丹黄酰尸胺（MDC）购于美国Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒购于上海碧云天公司。

1.3实验仪器 流式细胞仪（美国BD公司）、酶标仪（美国Thermo公司）、倒置荧光显微镜（德国LEICA公司）、低温高速旋转离心机（美国Beckman公司）、细胞培养孔板（美国NEST公司）。

1.4试剂配制

1.4.1 MDC溶液 将1 mg MDC粉末溶于1 mL无菌水中，可获得3 mmol/L的MDC溶液，取上述溶液100 μL加到6 mL无菌水中，获得实验用50 μmol/L的最终溶液，置于4℃冰箱避光保存备用。

1.4.2 DDP溶液 取1 mL浓度为5 mg/mL的DDP，用无菌水稀释到250 mL，即获得20 μg/mL的DDP用于实验，4℃冰箱保存。

2实验分组

该实验分为4组：空白对照组（加入等量的培养液做对照）、3-MA组（仅添加浓度为12.5 μg/mL的3-MA）、DDP组（仅添加浓度为20 μg/mL的DDP）、3-MA+DDP组（12.5 μg/mL的3-MA和20 μg/mL DDP同时添加）。

3实验方法

3.1细胞培养 骨肉瘤MG63细胞培养于提前配置好的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，其中含有100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素。在湿度饱和的情况下，培养于5%CO2、37°的培养箱中，隔天换一次培养液，3 d传代1次，取适量对数生长期的细胞进行下一步实验研究。

3.2 MTT比色法 外源性MTT在活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶作用下能够还原成蓝紫色结晶甲，且该结晶物质不溶于水，DMSO可使不溶于水的甲溶解，在490 nm波长处可以用酶标仪检测光吸收值，在死亡细胞中不存在上述反应过程，检测不到吸光度值，从而可以用来比较不同组之间细胞增殖率。取细胞数为1×108个/L，种植于96孔板中，分别在每孔添加等量的细胞悬液，细胞培养液培养10 h后根据实验分组在3个组中加入相应的药物，在恒温（37℃）5%CO2的环境下培养24 h后，将每孔加入等量的MTT溶液作用4 h，然后PBS溶液洗1遍，再加入等量的DMSO溶液，摇摆15 min，然后在酶标仪上检测不同组的吸光度值（A）。结合以下公式计算细胞增殖率：细胞增殖率（%）=（实验组A/对照组A）×100%。

3.3 MDC染色法 单丹黄酰尸胺（MDC）被细胞吸收后蓄积于嗜酸性的细胞囊泡中，在荧光显微镜下可以看到蓝绿色或黄绿色点状结构出现在细胞核周围，经常被用来检测细胞自噬囊泡的存在。取处于对数生长期的骨肉瘤MG63细胞（细胞数为1×105个/mL）加入24孔细胞培养板中培养12 h待细胞贴壁后根据实验分组加入相应浓度的药物继续培养24 h，24 h后加入MDC溶液（浓度为50 μmol/L）避光环境中培养1 h，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，用PBS洗涤，然后用倒置荧光显微镜观察自噬空泡差异；同样方法，经相应药物处理24 h后，MDC染色、4%多聚甲醛固定，PBS洗涤，然后分别收集各组细胞（不能收集倒置荧光显微镜观察过的细胞，以免影响细胞荧光强度），用流式细胞仪检测不同组细胞荧光强度。

3.4流式细胞术检测细胞凋亡率 磷脂酰丝氨酸位于正常细胞膜的内侧，但是在细胞凋亡的初期，磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，出现在细胞外环境中，也就是所谓的磷脂酰丝氨酸外翻。Annexin-V是一种分子量为35~36 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。 Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒是用带绿色荧光灯荧光探针FITC标记的Annexin，直接用流式细胞仪检测磷脂酰丝氨酸外翻这一细胞凋亡的重要特征，可以使坏死细胞呈绿色荧光。而碘化丙啶（PI）可以将坏死细胞和凋亡晚期失去细胞膜完整性的细胞染成红色。因正常细胞不被FITC和PI染色，所以二者结合可以较准确检测细胞凋亡情况。将细胞数为1×105个/mL的骨肉瘤MG63细胞种植于6孔板中培养，待细胞贴壁后，结合试验分组加入相应药物干预24 h，然后分组收集、离心细胞，PBS洗涤，按照Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒说明进行操作，经流式细胞仪检测细胞凋亡率，比较各组间差异。实验重复3次。

3.5统计学分析 用均数±标准差（x±s）表示实验结果，在SPSS 17.0统计软件帮助下进行统计学分析，多组间差异用单因素方差分析进行比较，取P

4结果

4.1 MTT法检测各组细胞增殖抑制率 MTT法检测结果显示：与对照组相比，单独添加3-MA对细胞增殖没有明显影响；单独添加DDP细胞增殖率为（47.6±3.1）%；与单独添加DDP相比，同时添加3-MA和DDP组细胞增殖率为（27.1±2.8）%，增殖率下降，P

4.2 MDC染色检测细胞自噬 MDC染色后在细胞核周围出现黄绿色的自噬空泡，与单独添加DDP组相比，3-MA和DDP同时添加组细胞自噬空泡较少。经倒置荧光显微镜拍片后显示，见图1。通过流式细胞仪检测各组荧光强度差异，结果提示：对照组为（83.1±8.2）%，单独添加3-MA组为（89.8±9.5）%，单独添加DDP组为（183.1±14.8）%，3-MA和DDP同时添加组为（121.5±10.4）%。3-MA和DDP同时添加组与单独添加DDP组相比，P

图1 不同组MDC染色后自噬空泡的变化

4.3流式细胞术检测细胞凋亡 经流式细胞仪检测我们发现，单独添加3-MA组细胞凋亡率为（2.5±0.4）%；单独添加DDP组为（12.5±1.1）%，与对照组相比，P

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

5讨论

骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性是决定治疗效果的关键因素，据统计仍有10%~25%患者对化疗反应较差，根本原因在于对化疗药物产生耐药性[1-2]。另外，临床上不合理、不规范的使用化疗药物也可引起肿瘤细胞对药物产生耐药性，将严重影响治疗效果。近些年多数研究[3-4]认为骨肉瘤的耐药性与多种肿瘤基因位点或传导通路有关，如骨肉瘤的生长、发展或耐药性与信号传导子STAT3通路的激活存在一定的相关性；肿瘤细胞对甲氨蝶呤耐药与异位转染miR-140存在联系等。由于新的化疗方案的实施，外加新的化疗辅助药物的应用，能很大程度上控制骨肉瘤的发展，产生良好治疗效果[5-6]。为了寻找更有效、更广泛的肿瘤化疗辅助药物，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对肿瘤耐药性的影响日益引起大家的关注[7-8]。

顺铂属于细胞周期非特异性药物，结构类似于双功能烷化剂，在DNA复制过程中发挥抑制作用。在骨肉瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌等实体恶性肿瘤中应用较广泛。自噬是细胞通过自身来消除细胞内部衰老或死亡细胞来维持内环境稳定的过程。3-甲基腺嘌呤可以通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ClassⅢPI3K），阻止自噬体与溶酶体形成自噬溶酶体，进而发挥抑制作用，是一种常见的自噬抑制剂，广泛应用于自噬相关基础研究[9]。MDC是特异性自噬体标记物，被MDC染色的细胞核周围可见蓝绿色或黄绿色点状结构，常用来检测细胞自噬囊泡[10]。

本研究结合临床中顺铂在骨肉瘤化疗中的应用，借助自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤来说明自噬在骨肉瘤化疗过程中的作用。经MTT比色法检测，我们发现3-MA+DDP组细胞增殖率明显低于单独添加DDP组，P

随着人们对自噬与肿瘤发生、发展机制研究的深入，我们不难发现通过调控自噬可以克服肿瘤耐药性，促进细胞凋亡，为临床获得良好的治疗效果提供实验依据，该研究也证实调控自噬在改进肿瘤治疗方案中有更宽阔的研究前景。但是如今，自噬抑制剂不能在临床上应用的主要原因主要有：①自噬在临床上还没有特异性的抑制剂，实验中应用的药物还不能直接应用于临床。②在临床上对自噬水平的检测到目前为止还没有一个客观定量的方法，比如根据一个血液标本或者肿瘤组织就可以检测到自噬水平。这两点也正是我们下一步继续努力研究的方向。

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