钙网蛋白的结构、功能与进化
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摘 要：钙网蛋白（calreticulin，CRT）是一种滞留于内质网的可溶性Ca2+结合蛋白，有N-、P-、C-三个结构功能域，具有分子伴侣和调节Ca2+的稳态等多种生物学功能。近来研究发现，CRT对凋亡细胞的识别和清除发挥重要作用。同源性分析表明CRT的进化高度保守。本文简要概述了CRT的结构、功能及进化的研究进展。
关键词：钙网蛋白 生物学功能 细胞凋亡 进化
中图分类号：Q9 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）06（a）-0226-02
钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是由oswald和maclennan 1974年第一次分离得到，1989年smith和koch、fliegel等人分别通过分子克隆方法得到CRT的cDNA序列。自此，CRT在很多实验室得到广泛研究。迄今为止，在脊椎动物、无脊椎动物和高等植物中均分离得到CRT的cDNA序列。而在酵母菌和原核生物中目前认为不存在CRT基因。
1 CRT的组成和结构
CRT是非肌肉细胞内质网中的主要钙结合蛋白，由单基因编码，含有一个氨基末端信号肽序列和一个羧基末端内质网滞留信号序列（KDEL）。这些特殊的氨基酸序列能够确保CRT进入和滞留在内质网中。序列预测表明，CRT有一个或多个非保守的N-连接型糖基化位点，N-末端功能域有三个保守的半胱氨酸残基位点，其中的两个半胱氨酸残基形成二硫键（C120-C146），这对CRT氨基末端区域的正确折叠可能很重要。
CRT有三个结构功能域，N-功能域、P-功能域和C-功能域（图1）。CRT的N-末端区域是一个高度折叠的球状结构，包含8个反向平行的β束连接着蛋白形成的环形结构，氨基酸序列非常保守，有4个组氨酸残基，能结合锌离子Zn2+。P-功能域有一个富含脯氨酸的序列，由两个三次重复的氨基酸序列PXXIXDPDAXKPEDWDE和GXWXPPXIXNPXYX 组成，这两个重复序列对CRT凝集素样分子伴侣的功能至关重要。P-功能域对于Ca2+有高的亲和力。C-末端区域是高度酸性的，末端有内质网滞留序列KDEL。在CRT的C-功能域每摩尔CRT可以结合超过25mol Ca2+，Ca2+与C-功能域的结合在控制CRT与PDI、ERp57和可能的其它分子伴侣相互作用方面发挥调控作用。
图1中小圆圈代表重复序列A（PxxIxDPDAxKPEDWDE），小方块代表重复序列B（GxWxPPxIxNPxYx），KDEL为内质网滞留信号[1]。
2 CRT的生物学功能和细胞凋亡
CRT在内质网、细胞核、细胞质和细胞外有广泛的功能。其中，Ca2+的稳态和分子伴侣是CRT在内质网中最重要的两个功能，细胞粘附和基因表达调控似乎是CRT在内质网以外的最重要的功能。CRT还有许多其它的功能，包括整合素调节、类固醇激素受体结合蛋白及自身免疫缺陷疾病等。作为分子伴侣，CRT可促进蛋白正确折叠和装配，招募其他折叠酶增加中间物正确折叠的比率。当内质网腔Ca2+浓度连续地变化时，CRT能够维持Ca2+稳态。CRT可利用它的分子伴侣和凝集素样功能调控Ca2+流动穿过内质网膜[2]。CRT与其他伴侣和未成熟多糖的相互作用依赖于Ca2+的存在。CRT参与调节细胞粘附、整合素依赖的Ca2+信号、类固醇敏感基因表达和T淋巴细胞活化，无论在体内还是体外实验都已被证明。在CRT的研究领域一个主要的争论是关于内质网外CRT依赖的调节功能的机制。CRT参与调节细胞黏附作用可能与调节钙粘连素基因表达、纽带蛋白、改变酪氨酸激酶和蛋白磷酸酶活性有关[3]。
近来研究表明，CRT在机体对凋亡细胞的识别和清除中发挥重要作用。细胞经历凋亡会使细胞质膜结构发生改变，在预凋亡的刺激下，CRT会暴露于细胞表面，作为一个免疫原性细胞死亡（ICD）信号，与二硫化物异构酶ERp57共同扮演了“吃我”的信号[4]，诱导吞噬细胞识别和清除凋亡细胞。
3 CRT的进化
CRT在脊椎动物、无脊椎动物和高等植物中广泛存在，关于CRT分子结构及相关生理和病理作用已有很多的研究，但是关于进化的报道较少。Kales等进化树分析显示，硬骨鱼CRT序列高度聚集在一起，哺乳动物和植物CRT分别独立聚集为一枝。ilerová等报道发现蚯蚓CRT与已知序列的无脊椎动物CRT具有很高的同源性（65%～75%）。
我们选取了在进化地位上有代表性的物种的CRT序列，包括人、猴、鼠、鸡、爪蟾、河豚、斑马鱼、文昌鱼、海鞘、海胆和线虫，分析了CRT在无脊椎动物和脊椎动物中的进化情况。CRT基因结构比较显示，从无脊椎动物到原索动物，编码外显子出现了不同程度的合并和拆分现象。线虫有3个编码外显子，2个内含子，海胆有8个编码外显子，7个内含子，两者同源性为67.2%。海胆与被囊动物海鞘均有8个外显子，7个内含子，同源性为64.2%，内含子的插入位置和内含子类型有很大不同。海胆缺失了对应于高等动物中4号外显子位置的编码外显子，内含子长度大量增加，8号外显子长度明显增加，内含子类型发生变化，内含子的插入位置与高等动物有较大差别。海胆5号和6号外显子与高等动物的相应外显子对应，但在海鞘中合并为一个外显子，作为尾索动物的海鞘基因结构与高等物种有较大的差别，突出了海鞘在进化中的特殊地位。从文昌鱼开始，CRT在物种中的进化已经变得很保守，与高等动物一样都有9个编码外显子，8个内含子。综上所述，从整个基因结构看，无脊椎动物及尾索动物的基因结构不稳定；而头索动物文昌鱼和脊椎动物的基因结构则相对稳定，从无脊椎动物到脊椎动物，基因有变长的趋势，内含子数目增加，基因结构变得复杂，符合生物进化一般规律。
多序列比对表明不同物种的CRT编码序列N端都具有信号肽，有两个典型的的钙结合蛋白家族特征序列KHEQKIDCGGGYI和IMFGPDICG，P-功能域有两个三倍重复序列以及C末端的内质网滞留信号序列KDEL（R/HDEL）。另外，不同物种CRT序列同源性均大于60%，小于等于98.3%，显著地表明了CRT进化的高度保守性。
4 结语
CRT是内质网中主要的钙结合蛋白，存在于高等生物除红细胞之外的所有细胞中，具有分子伴侣、调节Ca2+的稳态、细胞粘附和基因表达调控等多种生物学功能，另外，对凋亡细胞的识别和清除起着关键性的作用，具有高度的进化保守性。
迄今为止，有关CRT的分子结构及相关生理和病理功能有大量的研究，CRT的过量表达或者缺失与一系列的病理条件相关联，如恶性肿瘤的演化和进展。研究表明，CRT过表达在许多癌症中是一个促癌事件，但作用机制仍不明确，将来应该集中解释恶化前和侵入前CRT的影响以及确定可能的相关联的基因和信号途径的机制[5]。鉴于CRT在多种细胞过程和信号途径的复杂作用，CRT很可能成为肿瘤治疗的新的靶点。
参考文献
[1] 吴红艳，王艳林.钙网蛋白与肿瘤免疫[J].生命科学，2011（23）：1009-13.
[2] John LM，Lechleiter JD，Camacho P.Differential modulation of SERCA2 isoforms by calreticulin.The Journal of cell biology，1998（142）：963-73.
[3] Fadel MP，Szewczenko-Pawlikowski M， Leclerc P，Dziak E，Symonds JM， Blaschuk O，et al.Calreticulin affects beta-catenin-associated pathways.The Journal of biological chemistry，2001（276）：27083-9.
[4] Panaretakis T，Joza N，Modjtahedi N，Tesniere A，Vitale I，Durchschlag M， et al. The co-translocation of ERp57 and calreticulin determines the immunogenicity of cell death.Cell death and differentiation，2008（15）：1499-509.
[5] Zamanian M，Veerakumarasivam A， Abdullah S，Rosli R.Calreticulin and Cancer.Pathology oncology research：POR，2013.