高糖对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响

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[摘要] 目的：通过观察高糖对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响，从多元醇通路的角度探讨高糖造成腹膜间皮细胞损伤的可能机制。方法：采用人的网膜作为细胞来源，胰蛋白酶-EDTA消化法进行人腹膜间皮细胞的分离、培养，间接免疫荧光法对第二代细胞进行鉴定。第2~3代细胞同步后用于实验。观察葡萄糖浓度及其作用时间对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响。应用紫外分光光度计记录ＮＡＤＰＨ在340 ｎｍ处吸光值的下降表示醛糖还原酶活性。结果：①醛糖还原酶活性随葡萄糖浓度的增加而显著增加。②随着葡萄糖作用时间的延长，醛糖还原酶活性逐渐增加。结论：高糖以时间及剂量依赖的方式使腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性增加。

[关键词] 腹膜透析；腹膜间皮细胞；醛糖还原酶；多元醇通路

[中图分类号] R459.5 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2008）02（c）-032-02

本实验将利用体外培养的人腹膜间皮细胞（HPMC）观察高糖对腹膜间皮细胞（PMC）醛糖还原酶（AR）活性的影响，从多元醇通路的角度探讨高糖造成PMC损伤的可能机制，为今后应用醛糖还原酶抑制剂（ARI）减轻高糖透析液对PMC造成的损伤提供体外实验依据。

1材料与方法

1.1主要药品与试剂

M199细胞培养液（Gibco BRL公司），胎牛血清（中国科学院生物工程研究所产品），胰蛋白酶（DIFICO分装），DL－甘油醛（沈阳博尔美公司），NADPH（Roche公司）。

1.2主要实验仪器

超净台（SPEG AIR TECH），二氧化碳孵箱（NUAIRE），倒置显微镜(NIKON），紫外分光光度仪(BECMAN DU640），高速低温离心机(BECMAN CS-15R）。

1.3实验方法

1.3.1腹膜间皮细胞的分离、培养及鉴定腹膜间皮细胞的分离、培养采用人的网膜作为细胞来源，网膜标本均取自择期胃大部切除术患者正常大网膜。用0.125%胰蛋白酶-0.01%ＥＤＴＡ，37℃消化20 min，获得的腹膜间皮细胞接种于0.1%明胶包被的25 cm2的培养瓶中，加入M199培养液（含20%胎牛血清、青霉素100 Ｕ/ｍl、链霉素100 Ｕ/ｍl， L-谷氨酰胺30 mg/L）。5%ＣＯ2、37℃培养箱孵育，每隔2～3 ｄ换液1次。第2~3代达90%融合的细胞，应用含2%胎牛血清的培养液培养24 h，使细胞同步后用于实验。采用间接免疫荧光法对第二代细胞进行鉴定。

1.3.2葡萄糖（GS）对腹膜间皮细胞AR活性的影响剂量对腹膜间皮细胞AR活性的影响：实验组分为1.5%、2.5%、4.25% GS三组；对照组使用0.1%正常体液浓度的葡萄糖，各组均刺激24 h。时间对腹膜间皮细胞AR活性的影响：实验组使用1.5％GS分别作用1，3，6，12，24，48 h；对照组使用1.5％GS作用1 h。

1.3.3醛糖还原酶活性的测定参照Masato Tawata和Nishimura等[1，2]的方法，并加以改良。①胰酶消化收集细胞，细胞离心后收集于1.5 ｍｌ的EP管中。②冰上超声破膜。在0.1 M PBS-K缓冲液（pH7.2，含EDTA 2.5 mM））中超声破膜6次，每次5 s，每次间隔1 min。③高速低温离心制备细胞裂解上清。12 000 ｒ/ｍｉｎ，4℃，离心15 min，上清为粗酶提取液，用于测量AR活性。④紫外分光光度计测量AR活性。以ＮＡＤＰＨ在340ｎｍ处吸光值的下降表示ＡＲ活性。反应体系含：74 ｍｍｏｌ/Ｌ磷酸钾缓冲液(ｐＨ6.2)，10 ｍｍｏｌ/ＬＤＬ-甘油醛，0.15 ｍｍｏｌ/ＬＮＡＤＰＨ，0.1 ｍｌ酶提取液，总体积1 ｍｌ。反应以ＤＬ-甘油醛为底物，从添加酶开始，观察时间至少5 ｍｉｎ。1单位（U）酶活性表示每分钟1 μｍｏｌ ＮＡＤＰＨ被氧化的酶量，各组样本的酶活性用比活性进行比较，比活性=酶单位/各样本细胞数。

1.4统计学分析

实验数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用t检验，以ＳＰＳＳ统计软件进行处理。显著性差异标准为P

2结果

2.1人腹膜间皮细胞鉴定

倒置相差显微镜下观察细胞融合后形成铺路石样外观，呈现典型的上皮细胞形态学表现；免疫荧光结果：细胞角蛋白抗体染色在胞浆内呈绿色荧光，说明细胞角蛋白抗原阳性，为间皮细胞所特有，排除了成纤维细胞、内皮细胞和白细胞的可能性，证实分离培养的细胞是人腹膜间皮细胞。

2.2葡萄糖对腹膜间皮细胞AR活性的影响

2.2.1高糖对腹膜间皮细胞AR活性的剂量依赖关系图1显示，AR活性随葡萄糖浓度的增加而显著增加，在4.25％葡萄糖时较对照组增加5倍。

0.1%正常体液葡萄糖浓度为对照组，各组均刺激24 h，各组与对照组比较差异有显著性，*P

2.2.2高糖对腹膜间皮细胞AR活性的时间依赖关系

实验证实：随着葡萄糖作用时间的延长，AR活性逐渐增加，在24 h及48 h增加显著，作用48 h较1 h增加2.3倍。

1.5%葡萄糖刺激HPMC不同时间的AR活性与1 h时间点相比，差异有显著性，* P

3讨论

腹膜透析是终末期肾脏病患者肾衰一体化治疗的主要方法之一。腹膜间皮细胞（PMC）是构成腹膜的主要细胞群，保持其结构完整和功能稳定是腹膜透析得以长期有效进行的关键。葡萄糖作为腹膜透析液中应用最为广泛的渗透剂，其使用浓度为正常体液的15～45倍，PMC长期持续暴露于高糖透析液中可使腹膜间皮细胞肥大、再生修复障碍， 并可抑制腹膜间皮细胞增殖、诱导腹膜间皮细胞凋亡，造成PMC脱落，同时刺激PMC合成细胞外基质[3~7]，最终使腹膜纤维化和功能丧失，使腹透患者因超滤失败、透析效率下降，而放弃腹膜透析。目前，高糖造成HPMC损伤的机制尚不十分明确，因此研究高糖引发PMC损伤机制及防治措施至关重要。

多元醇通路(ＰＰ)是葡萄糖代谢的途径之一，AR是多元醇通路的关键限速酶，其在高糖条件下被激活。醛糖还原酶激活已被证实是多种糖尿病并发症的重要发病机制之一[8~11]。腹膜形态学的研究已证实腹膜血管的改变与糖尿病微血管病变相似[12]，而且腹膜透析所用的葡萄糖浓度远高于糖尿病患者的血糖水平，所以推测多元醇通路（PP）可能在高糖引发腹膜间皮细胞损伤中也起一定的作用。

Wong等[13]报道HPMC存在AR mRNA表达，高糖可使AR mRNA表达增加并使细胞内山梨醇蓄积，ARI可抑制细胞内山梨醇蓄积。由于国内尚无这方面报道，因此我们在实验中观察了高糖对人腹膜间皮细胞AR活性的影响，结果显示：在正常体液葡萄糖浓度时腹膜间皮细胞即表现AR活性，葡萄糖与AR活性之间存在时间和剂量依赖关系，即随着葡萄糖浓度的增加，AR活性逐渐增加，同时AR活性随作用时间的延长而增加。上述实验结果表明，高糖可通过诱导HPMC醛糖还原酶活性升高，进而激活多元醇通路。AR激活，在催化葡萄糖转化为不易透过细胞膜的山梨醇的过程中消耗了大量的还原性ＮＡＤＰＨ，引起机体抗氧化能力降低[14]，细胞内山梨醇聚集，造成细胞水肿及细胞渗透压的损伤[15]，细胞摄取磷酸肌醇能力障碍，胞内Ｎａ+-K+-ＡＴＰ酶活性下降[14]，从而导致细胞代谢紊乱和功能损害。因此推测腹透液葡萄糖浓度越高、腹透时间越长，其激活AR的作用越显著，通过上述机制对腹膜造成的损伤可能更大。

AR激活可能参与了高糖所致的腹膜间皮细胞损伤，这为今后应用醛糖还原酶抑制剂减轻高糖透析液对PMC造成的损伤提供了体外实验依据。

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（收稿日期：2007-11-13）

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