小麦成熟胚愈伤组织诱导的影响因素研究

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摘要 为了研究新疆小麦成熟胚愈伤组织诱导的影响因素，为建立高效和稳定的成熟胚愈伤诱导转化体系提出理论依据。选取有代表性的、在新疆大面积推广的高产、优质和广试性的新春9号、新春11号和新春26号等3个春小麦品种进行成熟胚愈伤组织诱导，对不同取材方式、培养条件、培养时间等3个因素进行了对比。结果表明，新春9号、新春26号采用刮碎胚的方式，在25 ℃环境下暗培养7 d，获得的愈伤组织适合进行农杆菌介导转化。

关键词 小麦；成熟胚；愈伤组织；诱导；影响因素

中图分类号 S512.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）01-0030-01

小麦是全世界最重要的粮食作物之一，但产量频繁受到非生物和生物胁迫的影响。近年来，新疆的小麦种植面积逐年上升，2014年计划种植面积113.33万hm2，其他省市育成的小麦品种很难适应新疆特有的干旱和高盐等胁迫生态环境，因此亟需充分利用新疆自育的小麦品种。

采用常规的育种方式获得小麦新品种（系）需要较长的育种周期，目前使用较多的是利用转基因方式培育新品种（系）[1]，利用分子改良技术来培育适应新疆环境的高产优质小麦[2]。通过转基因的方式进行小麦遗传转化所选用的受体材料一般是小麦的幼胚，再采用基因枪轰击或农杆菌介导的方式[3-4]进行遗传转化，再对愈伤组织进行诱导成苗；但小麦幼胚取材受到时间、空间和季节的限制，合适的取材时期均难以把握，所取材料的生理状态、发育阶段是否一致性也不能很好保障，在一定程度上制约了转基因小麦育种工作的有效开展与应用[5]。而小麦的成熟胚取材较方便，且不受季节、植株发育阶段等因素的限制，能保证不同个体间生理状态的一致性，因此建立高效的成熟胚再生体系已成为小麦遗传转化的关键所在。

本研究以新春9号、新春11号和新春26号等3个新疆春小麦品种成熟胚为受体，对不同的取材方式、培养时间和培养的温度进行探索，最终确定了适宜的愈伤组织诱导条件，为新疆小麦品种改良和分子育种提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采用新春9号、新春11号和新春26号等3个新疆的春小麦品种。培养基为愈伤组织诱导培养基，配方为MS大量+MS微量+铁盐+Na2EDTA+2，4-D +维生素B5+葡萄糖+水解酪蛋白，pH值5.8。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦材料灭菌方法。取小麦成熟种子，依次用70%酒精浸泡表面消毒10 min、25%次氯酸钠25 min灭菌，无菌水清洗3～5次，无菌水浸泡过夜。次日，在超净工作台内转入无菌培养皿中，先加入25%次氯酸钠灭菌15～20 min，再用无菌水清洗3～5次，倒尽水分，待用[6]。

1.2.2 小麦品种的成熟胚取材方式。试验设2个取材方式处理，分别为：在一灭菌培养皿内加几张灭菌滤纸，用镊子将种子固定，用解剖刀尖将种子胚部分翘下并用刀尖压碎，然后将成熟胚组织以胚为单位轻轻悬浮接种在愈伤诱导培养基上，在25 ℃的条件下，暗培养7 d（A）；在一灭菌培养皿内加几张灭菌滤纸，用镊子将种子固定，用解剖刀刀尖将种子成熟胚组织刮成碎屑[7]，尽量将胚刮得完全并且没有刮到胚乳，然后将成熟胚组织以胚为单位轻轻悬浮接种在愈伤诱导培养基上，在25 ℃的条件下，暗培养7 d（B）。

1.3 数据统计分析

测定统计愈伤组织诱导率，公式如下：

愈伤组织诱导率（%）=诱导出愈伤组织的外植体数

÷接种的外植体数×100

2 结果与分析

2.1 受体材料取材方式不同对愈伤组织诱导的影响

通过对2种不同取材方式（图1）获得的材料进行愈伤组织诱导，比较观察发现：经处理A取材方法处理后的小麦成熟胚愈伤组织半透明淡黄色，较松软，部分有颗粒状愈伤形成；经处理B方法处理后的小麦成熟胚愈伤组织半透明淡黄色，松软，愈伤颗粒小，水分含量较多。

李 卫等[6]研究结果表明，愈伤组织呈半透明致密小颗粒状易被侵染（图2），处理A的小麦成熟胚愈伤组织农杆菌菌液浸泡时大都呈小块，不易散开；处理B的小麦成熟胚愈伤组织在农杆菌菌液浸泡时会散开呈小颗粒状易被侵染。因此，应采用处理B刮碎胚的方式处理小麦成熟胚。

2.2 同一培养条件下不同品种的愈伤组织诱导率

在相同的培养条件下，将3种小麦成熟胚接种在愈伤诱导培养基上，培养10 d后观察发现：新春9号成熟胚愈伤组织大都呈淡黄色，有部分绿化，通过对4次重复结果计算，愈伤诱导率为91.3%；新春11号成熟胚愈伤组织颜色较黄且很少绿化，通过对4次重复结果计算，愈伤诱导率为89.5%；新春26号成熟胚愈伤组织部分绿化，通过对4次重复结果计算，愈伤诱导率为90.2%（表1）。

3 结论

本研究对在新疆大面积推广的高产、优质和广试性的新春9号、新春11号和新春26号等3个新疆春小麦品种进行成熟胚愈伤组织诱导，对不同取材方式、培养条件、培养时间等3个因素进行对比。结果显示：采用刮碎胚的方式获得的愈伤组织最适合进行农杆菌侵染；在相同培养条件下，3个小麦品种的成熟胚诱导率为新春9号91.3%、新春11号89.5%、新春26号90.2%，获得的愈伤组织较多，适于进行农杆菌介导转化体系的建立；通过对培养时间的对比，结果表明，暗培养7 d的愈伤组织是最适于农杆菌转化的材料；经过愈伤组织诱导条件探索，采用在25 ℃环境下暗培养7 d，获得的愈伤组织适合进行农杆菌介导转化。对转化后的愈伤进行恢复培养，初步筛选出转化效果较好的品种是新春9号和新春26号。

4 参考文献

[1] 张艳敏，郭北海，丁占生，等.小麦农杆菌转化系统的建立与转基因植株的获得[J].华北农学报，2003，18（3）：1-3.

[2] 于惠敏，夏光敏，侯丙凯，等.提高农杆菌介导小麦遗传转化效率的几个因素[J].山东大学学报：理学版，2005，40（6）：120-124.

[3] 陈立国，后猛，王玉海，等.农杆菌介导小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化研究[J].麦类作物学报，2007，27（2）：188-192.

[4] 丁莉萍，陈泠，李圣纯，等.根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究[J].麦类作物学报，2007，27（5）：761-766.

[5] 陶丽莉，殷桂香，叶兴国，等.小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究进展[J].麦类作物学报，2008，28（4）：713-718.

[6] 李卫，郭光沁，郑国锠，等.根癌农杆菌介导遗传转化研究的若干进展[J].科学通报，2000，45（8）：798-807.

[7] K HANNA H K，D AGGARD G E.A grobaterium tumefaciens mediated tans formation of wheat using a super binary vector and a polvamine supplemented regeneration medium[J].Plant Cell report，2003，21（3）：429-436.

基金项目 新疆农业大学大学生创新项目（jqzyp42011013）；新疆维吾尔自治区高校科研启动项目（XJEDU2011S20）；作物遗传育种重点学科资助项目。

收稿日期 2013-11-26