双水相体系与超声集成提取月季花总黄酮

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摘 要 目的：研究月季花中总黄酮的最佳提取方法。方法：以月季花总黄酮提取率为指标，采用乙醇-硫酸铵双水相体系集成超声提取法提取月季花中总黄酮，通过单因素试验和正交试验优选其最佳提取方法。结果：最佳提取条件确定为料液比1：50，醇水比0.6，硫酸铵浓度0.27 g/ml，超声提取50 min。结论：方法操作简便、效率高，优于回流提取。

关键词 双水相 超声提取 月季花 总黄酮

中图分类号：R284.2；TQ028 文献标识码：A 文章编号：1006-1533(2012)03-0029-03

Separation of total flavonoids from Rosa chinensis Jacp

by two-phase aqueous system synergism with ultrasound extraction

ZHANG Min-na1，ZHU Jun1，WANG Guang-hui2，WANG Ting1，DING Rui-fang，ZHANG Hua-li1

（1. Pharmaceutical College，Jining Medical Univerisity，Rizhao，276826；

2. College of Basic and Forensic Medicine，Jining Medical Univerisity，Jining，272067）

ABSTRACT Objective: To explore the optimal conditions for extraction of total flavones from Flos Rosae Chinensis. Methods: The extraction rate of flavones from Flos Rosae Chinensis was assigned to index，total flavones from Flos Rosae Chinensis were extracted by alcohol-ammonium sulfate two-phase aqueous system synergism with ultrasound extraction. The extraction conditions were optimized by single experiment and orthogonal test. Results: The optimal condition of extraction process was as follows: material-solvent ratio 1：50，ethanol-water ratio 0.6，the concentration of ammonium sulfate 0.27 g/ml and extracting for 50 min with ultrasonic wave. Conclusion: The proposed method is simple and effective，and much better than reflux extraction with heating.

KEY WORDS two-phase aqueous system；ultrasound extraction；Flos Rosae Chinensis；total flavonoids

月季花（Flos Rosae Chinensis）为蔷薇科植物月季（Rosa chinensis Jacg）的干燥花蕾或初开放的花，中医认为其性味甘温，具有活血调经之功效。月季花含有黄酮类、芳香油、鞣质、没食子酸等化学成分，其中的黄酮类成分具有增强机体免疫及抗癌等多种药理活性[1，2]。目前，月季花总黄酮提取方法有回流提取法、索氏提取法和溶剂浸提法等[3～5]。近年来，双水相分离技术引起了人们的重视，它利用物质在双水相体系中的选择性分配进行分离，具有活性损失小、分离步骤少、操作条件温和且易于工艺放大和连续操作等优点，在生物活性成分及天然产物有效成分的提取分离方面有良好的应用前景[6，7] 。本文采用乙醇-硫酸铵双水相体系并结合传统超声提取法，利用两种分离方法的优势，提取分离月季花中总黄酮，探讨提取工艺条件，为开发月季花总黄酮的先进提取分离技术及双水相技术的应用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用公司），KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），旋转蒸发仪（上海安亭科学仪器厂），真空泵，电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

1.2 材料与试剂

月季花药材购于济宁广联药店，用研钵磨成细粉备用；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200406）；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、硫酸铵均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 双水相体系的制备

低级醇-盐双水相体系参考文献[8，9]制备，其中水溶性有机溶剂选择乙醇，成相盐选择硫酸铵，通过改变乙醇与水的比例及硫酸铵的用量控制双水相体系的形成。

2.2 供试品溶液的制备

准确称取月季花粉末1.0 g于50 ml具塞锥形瓶中，加入20 ml石油醚超声30 min除去脂溶性成分，过滤，室温下挥干，按一定料液比加入不同醇水比和分相盐浓度配制的乙醇-硫酸铵双水相溶液，超声提取一定时间，于分液漏斗中静置，分取上层乙醇相清液，用60%乙醇定容至25 ml，即得。

2.3 标准曲线的绘制

精密称取芦丁对照品20.01 mg置100 ml量瓶中，用60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（0.200 1 mg/ml）。精密量取上述对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 ml，分别置于25 ml量瓶中，加入5% NaNO2溶液1 ml，静置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液1 ml，静置6 min，再加入4% NaOH溶液10 ml，用水定容至刻度，摇匀，静置15 min，以空白试剂为参比，分别于511 nm处测定吸光度。以浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，求得方程为：A=13.3C+0.038 4（r =0.999 5）。结果表明，该方法在8.004～56.03 μg/ml范围内线性关系良好。

2.4 样品总黄酮的分析

精密量取供试品溶液1.0 ml，按2.3项下方法显色并测定吸光度，将吸光度代入回归方程计算总黄酮浓度和样品中总黄酮质量，按下式计算总黄酮提取率[10]。

总黄酮提取率（%）=[提取液中总黄酮质量（g）/月季花粉末的质量（g）]×100%

2.5 最佳提取工艺的确定

2.5.1 单因素试验

分别考察超声提取时间、料液比、醇水比 （体积分数）、(NH4)2SO4浓度对月季花总黄酮提取率的影响。结果表明，总黄酮提取率随超声时间的增加而增大，在30～50 min内增加较快，50 min后基本不变；总黄酮提取率随提取溶剂量的增大先增后减，在料液比为1∶30～1∶40时增加较快，超过1∶50时开始降低；随乙醇体积分数的增大，总黄酮提取率先增后减，以醇水比为0.7时最佳；(NH4)2SO4浓度在0.27～0.30 g/ml之间，总黄酮提取率随着(NH4)2SO4浓度增加而增大，0.33 g/ml后开始降低。

2.5.2 正交试验

综合单因素试验结果，以料液比（A）、醇水比（B）、提取时间（C）和(NH4)2SO4浓度（D）4因素进行超声提取-双水相分离，每个因素设3个水平，做L9(34)正交试验，因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

由表2、3可知，各因素对总黄酮提取率影响程度由大到小依次为：A＞B＞D＞C，即料液比＞醇水比＞(NH4)2SO4浓度＞提取时间，其中料液比和醇水比对提取率有显著性影响（P＜0.05），最终确定最佳提取条件为A3B1C2D1，即用醇水比0.6的乙醇做提取溶剂，料液比1：50，(NH4)2SO4浓度0.27 g/ml的条件下超声50 min。

2.6 验证实验

取月季花药材粉末1.0 g，共5份，精密称定，按正交试验选取的最佳工艺提取制备样品，按2.3项下方法测定吸光度，计算得总黄酮平均提取率为4.42％，RSD为1.2%。

3 讨论

将本法确定的最佳提取工艺与乙醇-水回流提取法进行比较研究，乙醇-水回流提取法条件为：60%的乙醇溶液，料液比1：50，回流提取2 h。结果月季花总黄酮提取率为4.42％，乙醇-水回流提取法为3.89%。本法总黄酮提取率高于乙醇-水回流提取法，且提取温度低，所需时间较短，提取分离同时进行，操作简便，明显优于乙醇-水回流提取法，可为月季花总黄酮的分离纯化及开发利用提供有益参考。

参考文献

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（收稿日期：2011-10-26）