知芪益肾汤对实验性糖尿病大鼠肾功能的作用机制研究

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【摘要】 目的探讨知芪益肾汤对糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏的保护作用及其发生机制。方法 腹腔注射链尿佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,检测血糖、UAER、Ccr,应用免疫组化法检测CTGF及TGF-β1的蛋白表达。结果 知芪益肾汤组UAER、Ccr显著低于糖尿病组(P

【关键词】 糖尿病肾病;知芪益肾汤;转化生长因子β1(TGF-β1);结缔组织生长因子(CTGF)

糖尿病(DM)患者30%～40%可发生糖尿病肾病(DN)。细胞外基质(ECM)在肾小球系膜区及间质的进行性积聚是DN发生的重要环节,从而导致肾小球纤维化硬化[1] 。近年来转化生长因子β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF )的介导作用已引起广泛的关注,认为其可能为DN发病机制的最后共同通路。

1 材料

1.1 主要药物和试剂 二月龄雄性Wistar大鼠60只(体质量180 ～220 g),链尿佐菌素(STZ)(美国sigma公司生产)、兔抗大鼠TGF-β1及CTGF多克隆抗体(santa cruz公司产品)、spkit即用型及DAB显色试剂盒、中药(由黄芪、知母、山药等组成)。

1.2 仪器 美国邦培血糖仪、Olympus AU-1000全自动生化分析仪、Olympus CH30显微镜、 德国Leica RM2145石蜡切片机。

2 方法

2.1 模型的建立及分组给药 健康雄性Wistar大鼠适应性饲养7 d,禁食12 d后按60 mg/kg的剂量左下腹腔一次性注射STZ诱导糖尿病模型,72 h后取尾静脉血测血糖和尿糖,于第8周末,每组大鼠收集24 h尿液计量检测尿白蛋白定量,称重后,肾脏取皮质固定于10%中尔马林中、石蜡包埋、制成4 μm厚切片。大鼠经眼内眦取静脉血测血胆固醇、三酰甘油、血肌酐。

2.2 观察指标及其检测方法 给药8周后测空腹血糖; 检测糖化血红蛋白,血胆固醇、三酰甘油、血肌酐,检测 24 h尿微量白蛋白、计算内生肌酐清除率(Ccr),尿白蛋白排泄率(UAER)。

2.3 免疫组化检测 取固定好的石蜡切片,常规脱蜡、水化,用3%H2O2室温15 min灭活内源性过氧化物酶、微波加复合蛋白酶修复暴露抗原,滴加正常免血清封闭液,室温10 min滴加稀释的一抗(1∶100)4℃过夜,滴加生物素化二抗37℃ 15 min,DAB显色,苏木素轻度复染脱水透明中性树脂封片,显微镜观察。

2.4 统计学分析 所有数据均采用均数±标准差(x±s),采用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析,组间比较采用单因素方差分析,以P

3 结果

3.1 一般指标变化 与对照组相比,肾质量、肾脏肥大指数(肾质量/体质量)明显增加(P

3.2 各组血糖、糖化血红蛋白、胆固醇、三酰甘油的变化 模型组各数值较对照组均明显升高;知芪益肾汤组较模型组明显降低,但仍较对照组高(P

表1

表1 各组体质理、肾质理及肾脏肥大指数(肾质理/体质理)比较( x±s)

组别只 体质理(g)肾质理(g)肾质理/体质理(%)

NC 20 230.25±10.71 0.67±0.080.29±0.02

DN 20 177.87±15.61*1.18±0.11*0.59±0.07*

ZQYST 20195.37±7.99* 0.96±0.10*0.44±0.02*

注:与NC组比较*P

表2

各组血糖、糖化血红蛋白、胆固醇、三酰甘油比较(x±s,mmol/L)

组别只血糖糖化血红蛋白(%)胆固醇 三酰甘油

NC 204.92±0.524.37±0.61 1.33±0.520.61±0.07

DN 20 19.02±1.35* 10.41±0.78*1.82±0.04* 1.01±0.14*

ZQYST20 17.45±1.16*8.98±0.57* 1.46±0.04* 0.82±0.04*

注:与NC组比较*P

3.3 各组24 h尿微量白蛋白排泄率(UAER)、内生肌酐清除率(Ccr)的变化

模型组24 h UAER、Ccr较对照组均明显升高;知芪益肾汤组24 h UAER、Ccr较模型组明显降低,但仍较对照组高(P

作者单位:222042连云港市第一人民医院东方医院

表3

各组24 h UAER、Ccr比较(x±s)

组别 只 24 hUAER(mg/24 h)Ccr (ml/min)

NC20 0.18±0.090.65±0.14

DN200.82±0.08* 1.20±0.09*

ZQYST200.55±0.09*0.94±0.07

注:与NC组比较*P

3.4 免疫组化方法检测CTGF及TGF-β1表达

正常组无表达;糖尿病模型组表达明显增加;知芪益肾汤组也有表达,但阳性染色程度较模型组明显减弱(P

表4

各组肾脏TGF-β1、CTGF表达比较(x±s)

组别只 TGF-β1平均吸光度CTGF平均吸光度

NC 200.14±0.030.12±0.02

DN 200.25±0.03*0.22±0.04*

ZQYST200.19±0.020.18±0.03

注:与NC组比较*P

图1 各组大鼠肾组织TGF-β1免疫组化(×400)

A.正常对照组 B.糖尿病组 C.知芪益肾汤组

图2 各组大鼠肾组织CTGF免疫组化(×400)

A.正常对照组 B.糖尿病组 C.知芪益肾汤组

4 讨论

糖尿病肾病的早期病理学改变特征是肾脏体积增大,肾小球和肾小管基底膜增后及细胞外基质( ECM)进行性积聚,肾小管问质纤维化。在这一过程中,TGF-β1和CTGF 的介导作用已引起广泛的关注,认为其可能为DN发病机制的最后共同通路。

TGF-β1被认为是促进ECM合成,导致DN进展的核心因子及致肾脏纤维化共同最终信号通路 [2]。现已研究证实高糖环境是导致TGF-β1自分泌产生和活化的原因之一[3]。体外实验表明,在高糖环境中培养的肾小球系膜细胞和近曲小管细胞发生肥大,细胞外基质积聚增加。高糖的这一作用是通过自分泌TGF-β1介导的,而TGF-β1反过来又增加葡萄糖的摄取和利用,两者相互作用的结果是促进细胞外基质积聚沉淀。CTGF是介导TGF-β1的致纤维化作用的下游因子,在诸多纤维化疾病模型研究中都发现CTGF的高表达。Gilbert等[4]对糖尿病患者的研究中,利用人的肾间质活检标本,应用原位杂交方法观察到肾小管部位,较高表达CTGFmRNA的细胞数目增加,以肾小管上皮细胞为主,并且与损害程度相关联。

体外和体内实验结果提示CTGF作为TGF-β1的下游信号介质,可能是包括DN在内的进行性肾小球硬化病变的一个重要介导因素[5]。依据本实验研究结果可知知芪益肾汤抑制TGF-β1、CTGF的表达,一方面可能是通过直接阻断其与受体的结合而实现的,另一方面也可能是通过降低血糖,间接抑制其表达而实现的,但这尚需要进一步研究证实。

参 考 文 献

[1] Guo B, Koya D, Isono M, et al.Peroxisome proliferator-activated receptor- gamma ligands inhibit TGF-beta1-induced fibronectin expression in glomerular mesagial cells.Diabetes, 2004,53(1):200-208.

[2] Pantsulaia T,Role of TGF-beta in pathogenesis of diabetic nephropathy.Georgian Med News,2006,2(131):13-18.

[3] 李红,徐蓉娟,唐红等.转化生长因子β1在早期糖尿病大鼠血清中的含量及其意义.中华内分泌代谢杂志,2001,1(3):186-187

[4] Gillbert RE,Akdeniz A,Weitz S,et al.Urinary connective tissue growth factor excretion in patients with type I diabetes and nephropathy.Diabetes Care,2003,26(9):2632-2636.

[5] Riser BL,Cortes P.Connective tissue growth factor and its regulation:a new element in diabetic glomerulosclerosis.Ren Fail, 2001,23(3):459-470.