白芍微粉细胞破壁率的测定
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[摘要] 目的：建立白芍微粉细胞破壁率的检测方法。方法：采用细胞计数法，以薄壁细胞为评价指标，考察超细粉碎技术对白芍细胞破壁率的影响，测定白芍微粉的细胞破壁率。结果：白芍细粉称样量与完整细胞计数的回归分析结果表明，两者呈显著相关性。白芍经超细粉碎后细胞破壁率为97.01％。结论：白芍粉末细胞计数方法简便，稳定，可靠。
[关键词] 细胞破壁率；细胞计数法；微粉；薄壁细胞；显微分析；白芍
[中图分类号] R28[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）03（c）-013-03
Determination of wall-broken rate on Raidix Paeoniae Alba micropowder
LI Ya, CAI Guangxian, YANG Yonghua, YANG Ying, WEN Junda
(Research Center of Ultra-micro Engineering， Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha410000, China)
[Abstract] Objective: To establish a method to determine wall-broken rate on Raidix Paeoniae Alba micropowder. Methods: Cytometry was used to investigate the influence of ultra-pulverization on Raidix Paeoniae Alba, and wall-broken rate on Raidix Paeoniae Alba micropowder was also determined. Results: The regression analysis result of the weight of Raidix Paeoniae Alba powder and the number of complete cell indicated that both correlated significantly. Wall-broken rate on Raidix Paeoniae Alba micropowder was 97.01%. Conclusion: Cell counting method on the powder of Raidix Paeoniae Alba is convenient, stable and reliable.
[Key words] Wall-broken Rate; Cell counting method; Micropowder; Parenchyma cell; Microscopy; Raidix Paeoniae Alba
白芍为毛莨科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall．）的干燥根，主产于湖南、四川等地，具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗之功效[1]，其主要有效成分为芍药苷[2]。白芍超微饮片系我院研制开发的一种微米级新型饮片，主要通过机械粉碎使细胞壁破裂，促使有效成分快速释放[3]。细胞壁的破裂程度直接影响超微饮片中有效成分的溶出，关系到临床药效的强弱，因此，细胞破壁率常被认为是评价中药粉末质量的重要指标之一，但目前仅见关于花粉与孢子类中药破壁率测定的研究报道。不同中药细胞的破壁率测定是中药超细粉碎技术的关键所在，本文拟针对白芍的显微特征，选择评价指标，对细胞破壁率的测定进行探索。
不同中药具有不同的显微特征，每一种显微特征具有固定的常数，根据这一原理，本课题借鉴显微定量法[4]，采用目视法，以白芍细粉为参照物，通过对白芍粉末的完整细胞计数，进行细胞破壁率的测定，考察超细粉碎工艺对白芍药材细胞破壁率的影响。
白芍的显微特征包括薄壁细胞、草酸钙簇晶、草酸钙方晶、导管、淀粉粒、木纤维及管胞[5]。其中薄壁细胞呈类方形、椭圆形或类长方形，壁稍厚，或呈连珠状，显微镜下易于观察，适合于作为检测指标进行破壁率的测定。
1 材料、仪器及样品制备
1.1 材料
白芍药材购自湖南省药材公司，经鉴定符合《中国药典》2005年版一部有关规定。
1.2 仪器
FFl-15型柴日式粉碎机（湖南雪峰机械厂），BFM-T6BI型振动研磨混炼机（济南贝利公司），微量吸管，WINNER99显微颗粒图像分析仪（包括三目显微镜、CCD图像采集系统、计算机图像处理软件）。甘油、水合氯醛均为分析纯。
1.3 样品的制备
细粉制备：取白芍药材干燥至水分约为6％，粉碎成细粉（过100目），备用。
微粉制备：称取白芍细粉加入料斗中，进行超细粉碎，收集微粉（过300目），备用。
2 方法与结果
2.1 白芍细粉细胞计数及其标准曲线绘制[6-7]
精密称取0.089 6、0.100 5、0.121 5、0.126 6、0.151 2 g细粉，分别置于25 ml容量瓶中，加稀甘油适量，超声处理5 min，使粉末分散均匀，定容至刻度。精密吸取药液30 μl，装片（装片时，使混悬液布满整个盖玻片，以不溢出，无气泡为度），分别置WINNER99显微图象分析仪（40×）观察。参照资料[8]，从白芍粉末显微特征图（图1、2）可以看出，除草酸钙、淀粉等后含物外，木纤维、导管等细胞均已截断，未见完整细胞。故考察白芍微粉的细胞破壁率宜选择其薄壁细胞破壁率的测定。因此，以白芍细粉中完整的薄壁细胞为显微特征计数物指标，显微观察示其为完整的不规则圆形，此特征具有代表性，故进行计数（以1个视野为1个计数单位，每个浓度的药液取8个计数单位的平均值），结果见表1。
表1 不同称样量中完整薄壁细胞的个数（n＝8）
以细粉的称样量为横坐标，每个计数中完整的薄壁细胞平均数为纵坐标，绘制标准曲线，得回归曲线方程Y＝97.392X-3.0556，r=0.991 4，说明白芍细粉中完整薄壁细胞在0.089 6～0.151 2 g范围内线性关系良好，可用来作为显微特征计数。
2.2 白芍细粉细胞计数方法学考察
2.2.1 精密度试验精密称取0.125 4 g细粉，同“2.1”项下方法制片，分别观察6个视野，相对标准偏差（RSD）为8.42％，表明本方法精密度较好。
2.2.2 稳定性试验取“2.2.1”项下样品，室温放置，分别于0、3、6、9、12 h于显微镜下观察，相对标准偏差（RSD）为10.07％，表明混悬液在12 h内较为稳定。
2.2.3 重复性试验取同一白芍细粉6份，同法制片，于显微镜下观察，相对标准偏差（RSD）为9.27％，表明本方法重复性较好。
2.3 白芍微粉细胞破壁率的检测
分别取白芍细粉与微粉，精密称取，按2.1项下制片，于显微镜下观察，分别观察25个视野（图3、4），根据两者完整薄壁细胞个数、混悬液体积、称样量，按下列公式计算白芍细粉和微粉的显微特征个数[9]：
白芍粉末显微特征个数/mg=―――
式中：X为每个盖玻片下的特征数；V为药材混悬液总体积（ml）；V′为盖玻片下混悬液体积（ml）；W为药材称取量（mg）。
再根据白芍细粉和微粉的显微特征个数，按下列公式计算细胞破壁率[9]：
Y=（A-B）/A×100%
Y：细胞破壁率；A：白芍细粉显微特征个数；B：白芍微粉的显微特征个数。
各项参数见表2。
3 结论
超细粉碎可使白芍药材的细胞破壁率达97.01％，以薄壁细胞为计数指标的细胞破壁率测定方法简便、可行。
4 讨论
本文首次对白芍微粉进行细胞破壁率的测定，以白芍粉末完整的薄壁细胞作为特征计数物，采用细胞计数法考察超细粉碎对白芍药材细胞破壁率的影响，该方法简单、可靠，对于测定中药粉末的细胞破壁率具有借鉴作用，也为中药超细粉末的质量研究提供了细胞破壁率测定新的思路。
通过对稀甘油、水合氯醛等分散溶媒的对比分析，发现采用稀甘油试液处理后观察的白芍细粉显微图像较为清晰，因此，选择稀甘油作为分散介质。
影响破壁率检测精确度的主要因素是回归方程的精确性和未破壁细胞计数的精确性。对于回归方程，由于称样量的误差可以忽略，每个计数单位内细胞平均数的精确性是最主要的影响因素。通过直观分析法得出，混悬液浓度为主要因素，观察倍数和展开面积次之，最佳条件是混悬液浓度为6.168 mg/ml，目镜10×，物镜10×。
超细粉碎工艺对于不同质地的中药材，粉碎效果不同；关于细胞破壁率与粒径的相关性正在研究中，其内在的规律有待考察。
[参考文献]
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（收稿日期：2008-07-07）