三个新的大白菜CBL基因的鉴定和特征分析

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摘 要：利用大白菜已知CBL基因序列，在公共核酸数据库中重新搜索比对大白菜的基因组序列，鉴定出3个新的大白菜cbl基因，并对这3个基因的结构、遗传进化和顺式元件进行了分析，为进一步克隆和研究这些基因的功能提供了有益借鉴。

关键词：大白菜；CBL基因；基因结构；遗传进化；顺式元件

中图分类号：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）12-0007-04

Identification and Characteristics Analysis of Three Novel

CBL Genes from Chinese Cabbage

Zhang YongTao1， Liu LiFeng2， Li HuaYin2， Zhang YiHui2， Wang HuanQin3，

Wang FengDe2， Gao JianWei2， Li LiBin2*

（1.Institute of Vegetables， Linyi Academy of Agricultural Sciences， Linyi 276012， China；

2.Institute of Vegetables， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory for Biology of

Greenhouse Vegetables/Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center， Jinan 250100， China；

3.Leling Agricultural Bureau， Leling 253600， China）

Abstract Three novel CBL genes were indentified from Chinese cabbage by using the known CBL genes of Chinese cabbage as queries to blast the Chinese genome sequences in public nuclear acid databases. The structure， phylogeny and cis-elements of these genes were analyzed. This study provided valuable information for further cloning and functional analysis of these novel CBL genes.

Key words Chinese cabbage； CBL genes； Gene structure； Phylogeny；Cis-elements

近年来研究表明，植物中一类与钙结合的蛋白（类钙调磷酸酶B亚基蛋白，Calcineurin-B like protein）基因CBL家族在植物应答干旱、盐碱、低温胁迫、矿质营养吸收、ABA以及钙信号转导过程中具有重要功能[2，5，10，13，15，17]，CBL蛋白主要是作为钙感受器与一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CIPK）互作来调控下游基因的表达，以响应各种不同的逆境和激素信号[2，4]。例如，在拟南芥中CBL4（SOS3）和CBL10蛋白可以和CIPK24（SOS2）结合，调控下游基因SOS1（钠离子/质子-反向运输的载体）的表达，促进细胞中钠离子的排出，从而提高植物对盐胁迫的抗性[2，11，16]。又如，在拟南芥中CBL1和CBL9与CIPK23结合，调控下游基因AKT1的表达，从而促进钾离子的吸收[7，17]。另外，AtCBL2和CIPK11结合可以调控拟南芥对碱（高pH）的抗性[8]；拟南芥AtCBL1、2、3、5、10基因在干旱、盐胁迫和ABA信号应答过程中具有重要功能[4，9，12，14，16]。在水稻、玉米等农作物中也有研究[3，8，9，11]，但在我国重要蔬菜作物中缺乏系统研究。在以往的研究中，本文作者通过生物信息学分析，从大白菜基因组中鉴定出13个CBL基因，并对它们的遗传进化进行了分析[1]。在此基础上，作者利用大白菜已知CBL基因序列，在公共核酸数据库中重新搜索比对大白菜的基因组序列，鉴定出3个新的大白菜CBL基因，并对这3个基因的结构、遗传进化和顺式元件进行了分析，为进一步克隆和研究这些基因的功能奠定了基础。

1 研究方法

利用大白菜已知CBL基因序列在GenBank中重新搜索比对大白菜的基因组序列 （http：//blastncbinlmnihgov/Blastcgi），寻找新的大白菜CBL基因序列，对鉴定出的CBL新基因进行结构分析和遗传进化分析，并对它们启动子序列中的顺式元件进行预测。结构分析利用GSDS（http：//gsdscbipkueducn/）在线进行，遗传进化分析利用MEGA41进行，采用Bootstrap test-Neighbor Joining 方法，重复500次运算，顺式元件预测采用PlantCARE软件进行在线分析。亚细胞定位预测在WoLF PSORT （http：//wolfpsortorg/） 中进行。

2 结果与分析

21 大白菜3个新CBL基因的鉴定和结构特征分析

利用已知的大白菜CBL基因序列，在GenBank中重新搜索和比对，发现了3个新的大白菜CBL基因，分别位于大白菜A01和A10染色体上的BAC AC2347501、CU6953051和FP325321中，它们在大白菜基因组数据库BRAD中对应的基因位点分别为Bra002301、Bra026421和Bra011404。在BRAD中，Bra002301解析的编码区为333 bp，不仅与我们的结果大不相同，与拟南芥等物种中的CBL编码区大小也相差甚远。据此认为，Bra002301的解析结果可能不正确， 而BRAD中Bra011404的解析结果与本文一致。Bra026421的编码区为657 bp，与本文的解析结果相近。另外，本文还发现，CU6953051中的CBL基因可能存在可变剪切，预测编码区大小还有822 bp和762 bp两种形式。这3个新基因基因组序列中内含子的数目分别为7和6，外显子-内含子结构如图1所示。它们预测编码的蛋白可能分别定位到细胞核、细胞质和叶绿体中（见表1），显示在功能上可能有所不同。

注：方框代表外显子，线代表内含子。

图1 大白菜3个新CBL基因的外显子-内含子结构

22 大白菜3个新CBL基因的进化分析

这3个新的大白菜CBL基因与拟南芥和已知13个大白菜CBL基因的系统进化关系如图2所示。AC2347501与AtCBL5直系同源；FP325321与BrCBL10关系最近，为姊妹对基因，并分别与AtCBL10直系同源；CU6953051与BrCBL3为姊妹对基因，和AtCBL2在一个类群中。现有研究表明，AtCBL2在高pH抗性和ABA应答中具有重要功能[7，17]，AtCBL5的过表达可以增强植物对干旱和渗透胁迫的抗性[18]，而AtCBL10在植物盐胁迫应答过程中具有重要功能[15]。因此，本文推测大白菜AC2347501在渗透胁迫应答过程中具有一定功能，CU6953051可能参与高pH抗性和ABA应答过程，而FP325321可能参与盐胁迫应答过程。23 大白菜新CBL基因的顺式调控元件

为了研究大白菜新CBL基因的功能和表达模式，我们对其启动子及其上游序列中的顺式反应元件进行了分析和预测。结果表明，大白菜新CBL基因拥有多种逆境和激素应答元件，且各不相同。这3个新基因都含有干旱应答元件MBS和逆境与病原物应答元件TC-rich 重复序列，而且只有FP325121含有脱落酸响应元件ABRE、赤霉素响应元件GARE、生长素应答元件TGA、水杨酸应答元件TCA和冷胁迫应答元件LTR，没有茉莉酸甲酯响应元件CGTCA和热胁迫应答元件HSE，此外，它还有乙烯应答元件ERE；CU6953051

图2 大白菜与拟南芥CBL基因的进化分析

含有的顺式元件较少，除MBS和TC-rich序列外，还含有一个茉莉酸甲酯响应元件CGTCA；而AC2347501还有乙烯应答元件ERE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA、热胁迫应答元件HSE。这说明这3个基因在激素和逆境响应过程中的功能有所不同，FP325321可响应多种激素信号以及干旱、温度和病原物胁迫，而CU6953051 可能响应茉莉酸甲酯信号和干旱及病原物胁迫，AC2347501可响应乙烯和茉莉酸甲酯信号以及热胁迫、干旱胁迫及病原物胁迫。

3 结论

通过基因组数据深入挖掘，从大白菜基因组中鉴定出3个新的CBL基因，序列分析和遗传进化分析发现这3个新基因确实与已知的13个大白菜CBL基因不同。至此，我们已发现在大白菜基因组中至少存在着16个CBL基因。顺式调控元件分析显示，这3个新的大白菜CBL基因的上游序列中含有的激素和逆境应答元件各不相同，说明它们在功能上可能有所不同。根据遗传进化分析的结果和已知拟南芥相应基因的功能，推测大白菜AC2347501在渗透胁迫应答过程中具有一定功能，CU6953051可能参与高pH抗性和ABA应答过程，而FP325321可能参与盐胁迫应答过程。至于它们实际功能如何，还需要实验进一步验证。本文为进一步克隆和研究这3个大白菜新的CBL基因的功能奠定了基础。参 考 文 献：

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