细胞培养实验中一些细节问题的探讨
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摘要：在细胞培养实验中，血清的处理和细胞的冻存这两方面的问题，是较为复杂也是比较容易出错的。而血清处理和细胞冻存过程中的技术细节若处理不当，会对细胞培养的效果产生较明显的影响。就理论学习及实验操作中获得的经验，对血清的保存、解冻、沉淀物l和热灭活的问题，及细胞冻存的方法和注意事项等细节问题作一总结。
关键词：细胞培养；血清；细胞冻存
中图分类号：R329.2
文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2009)06-1189-03
在细胞培养的理论学习和实验操作中，笔者发现，处理血清及冻存细胞方面的一些技术问题是比较复杂和较容易出错的。而如果这些细节处理不当，会明显地影响细胞培养的效果。现在结合笔者细胞培养实验的经验，对这些技术细节问题进行总结，并与大家探讨。
1 血清处理方面的问题
现代使用的合成培养基的成分和含量已经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要。所以，在合成培养基中都要或多或少地加入一定比例的天然培养基加以补充。目前天然培养基多采用胎牛血清或小牛血清，加入比例从百分之几到百分之几十不等。血清在细胞培养中的作用是十分重要的，所以下面就将笔者在实验中，学习中发现的处理血清的技术进行总结。
1.1保存和解冻
血清必须贮于－20～－70℃中保存。若存放于4℃，不能超过1个月。勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成分亦会因此受到破坏，而影响血清之晶质。如果1次无法用完1瓶，可将血清40～45mL分装于无菌的50mL离心管中，每次依用量取出。由于血清结冻时体积会增加约10％，装管时必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生血清挤出容器发生污染，或容器冻裂。
要解冻使用血清时，应使用逐步解冻法，才不会使血清质量受损。具体步骤是，从-20℃或-70℃，放至4℃冰箱溶解1天，再至室温下全溶后再进行分装。一般用50mL无菌离心管可分装40～45mL血清。在溶解过程中必须注意的是，要一直规则均匀摇晃(小心勿造成气泡，有损质量)，使温度与成分始终均一，减少沉淀现象的发生。勿直接由-20℃放至37℃快速解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生大量沉淀。
一般厂商提供之血清为无菌血清，不需再进行无菌过滤。若发现血清有许多沉淀物，应该将血清加入培养基内，与培养基混合一起过滤。不要直接过滤血清。
1.2血清中的沉淀物
1.2.1沉淀物的类型
(1)凝絮状物：如浮云或棉絮状。凝絮物发生的原因有许多种，但较普遍的原因是血清中的脂蛋白发生变性，及解冻后血清中出现的血纤维蛋白造成。这些凝絮状沉淀物若量不是太大，一般不会影响血清本身的品质。但如果想减少这些凝絮状沉淀物，可用离心机进行离心(3000r／min，5min)去除；离心后的上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议使用直接过滤去除这些凝絮状沉淀物，因为它会迅速阻塞过滤膜。
(2)显微镜下观察的“小黑点”：通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著地增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是一些“小黑点”，实验者常会误认为血清遭到了污染，而如果将此血清放在37℃中欲培养这些“微生物”，在37℃环境下，又会使这些沉淀物更加增多，更会误认为是微生物的增殖；但用培养细菌之培养基进行检测，又显示没有污染。一般而言，此小黑点应该不会影响细胞的生长。但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。
1.2.2如何避免沉淀物的产生(1)解冻血清时，应按照逐步解冻法(从-20℃至4℃，再至室温)。若血清解冻时温度的改变太大(如从-20℃直接至37℃)，非常容易产生较大量的沉淀物。
(2)解冻血清时(尤其是在37qc解冻步骤时)，应一直将之均匀地摇晃，使其温度及成分均一。这样可以减少沉淀的发生。
(3)勿将血清置于37℃时间太长。若在37℃放置太久，血清会变得混浊；同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
(4)对血清进行热灭活，非常容易造成沉淀物的增多。若非必要，可以无须做此步骤。如果必须做血清的热灭活，应遵守56℃、30min的原则，并且要一直将其摇晃均匀。灭活的温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的显著增多。
(5)实验中发现，储存在4℃冰箱中的胎牛血清有时会出现沉淀。原因是这些血清没有进行预老化，当它储存在2～8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能发生聚集，形成沉淀物或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。笔者建议在-20℃储存胎牛血清。而且要避免反复地冻融。
1.3关于血清的热灭活
热灭活(heat―inactivation)，指在56℃中，30min加热已完全解冻了的血清。此热处理之目的是使血清中之补体成分去活化，灭活补体系统。只有在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，才推荐使用热灭活血清。
细胞培养实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言不是必要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或者可以说完全没有任何作用；反而经常会因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而且经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察像是许多的“小黑点”。
所以，除非实验必须，一般不建议对血清作此处理。如果必须要进行热灭活，必须遵守56℃，30min的原则，而且在加热过程中必须一直规则均匀摇晃。以减少沉淀物，最大限度地保存血清的品质。
2 细胞冻存方面的问题
培养实验中，细胞的获得是不确定的。一旦成功，将会培养出大量的细胞，通常超过了研究所需。这样许多细胞将会被浪费掉。把培养出的细胞长期冻存起来，可以让其发挥在科学研究及临床应用中的最大限度的应用。目前国际上尚未有一个标准的冻存方法。
任何冻存方法的最终目的，都是最小化可以损伤细胞亚结构的细胞内冰晶形成，从而保持解冻后细胞活性、黏附能力及代谢活性。一个成功的冻存方法主要取决于冻存的速度、冻存细胞的浓度、冻存保护剂的类型及终浓度等。
2.1冻存细胞的方法步骤
2.1.1准备工作(1)冻存前1天须更换半量或全量的培养液，并观察细胞的生长情形。(2)配制冻存液(在使用前配制)：将DMSO(二甲基亚砜)加入新鲜培养基中，最终浓度为5％～10％。混合均匀，置于室温下冷却待用。
2.1.2冻存按照细胞传代培养进行操作。收集培养的细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1mL)计数细胞浓度及冻存前存活率。
2.1.3离心去除上清液。加入适量的冻存液，使细胞浓度为1―5×106cells／mL。混合均匀，分装于已标示完全的