三羟基异黄酮对肝纤维化大鼠血清和肝组织中TGF-β1表达的影响

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【摘要】 目的 观察4,5, 7-三羟基异黄酮(Genistein)对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠的防治作用及对转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法 采用CCl4造成大鼠肝纤维化模型,在实验的第10周末采血和取肝组织,检测血清中ALT、AST、TGF-β1和Ⅰ型胶原,HE染色法观察肝组织改变, 免疫组织化学法检测肝组织tgf-β1表达。结果 血清学检测显示Genistein能明显降低肝纤维化大鼠ALT、AST、TGF-β1和Ⅰ型胶原水平,病理组织学观察发现Genistein能明显改善肝纤维化大鼠肝组织结构和肝纤维化, 免疫组织化学检测表明肝组织TGF-β1表达量与模型组比较显著降低。结论 Genistein对CCl4诱导的肝纤维化大鼠有较好的保护作用, 对TGF-β1表达的影响可能是其作用机制之一。

【关键词】 三羟基异黄酮;肝纤维化;TGF-β1

Effect of Genistein on TGF-β1 in plasma and hepatic tissue of CCl4-induced hepatic fibrosis rats

LIAO Ming.Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

【Abstract】 Objective To investigate the antifibrotic effect of 4, 5, 7-Genistein on CCl4-induced liver fibrosis in rats and expression of TGF-β1. Methods A hepatic fibrosismodel was induced by CCl4.The levels of alanine transaminase (ALT), aspartic transaminase (AST), TGF-β1 and type-Ⅰcollagen in plasma were detected by chemical kit. The deposition of collagen was observed with H&E staining. The expression of TGF-β1 in hepatic tissue was observed by immuno-histochemistry. Results The concentration of serum ALT, AST, TGF-β1 and type-Ⅰcollagen was significantly reduced in the middle and high dose treated groups compared with that of model group. A significant reduction of collagen deposition and rearrangement in Genistein -treated group was displayed in histopathological changes. The expression of TGF-β1 was considerably decreased in the treated animals. Conclusion Genistein has an obvious protective effect on model rats, and remarkably inhibits TGF-β1 expression in plasma and liver tissue which is thought to be one possible antifibrogenic mechanism.

【Key words】 Genistein; Hepatic fibrosis; TGF-β

基金项目:广西地方性高发疾病防治研究重点实验室开放基金(项目编号:桂科能0842009-k5)

作者单位:530021 广西医科大学

肝纤维化是各种原因引起的慢性肝损伤所共有的病理改变,其特征是以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在肝内过量沉积。肝组织胶原沉积曾被认为是有害的和不可逆转的过程,但近来大量的临床和实验室证据均表明早期肝纤维化有逆转的可能[1,2] 。转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)是强有力的致纤维化的细胞因子,在肝纤维化时表达明显增多,促进肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)增殖活化,合成大量ECM,在纤维化进程中起重要作用[3]。

4, 5, 7-三羟基异黄酮( Genistein)是来源于豆类植物的异黄酮类化合物,近年来研究显示其具有明显的抗肿瘤作用。笔者在前期的研究中发现Genistein具有抗肝纤维化作用,可抑制大鼠HSC-T6的增值,能显著增强MMP-2 mRNA的表达,抑制TGF-β1和TIMP-2 mRNA的表达[4]。本研究采用CCl4诱导大鼠肝纤维化模型, 检测血清中ALT、AST、TGF-β1和Ⅰ型胶原,HE染色法观察肝组织改变, 免疫组织化学检测肝组织TGF-β1表达水平,探讨Genistein对肝纤维化大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品与试剂 SD雄性大鼠,体质量180～220 g,由广西医科大学实验动物中心提供,合格证号: SCXK(桂2003-0003)。4, 5, 7-三羟基异黄酮(深圳市迈瑞尔化学技术有限公司批号: 20081208);秋水仙碱: (sigma公司);CCl4(重庆川江化学试剂厂,批号: 081011);实验时用花生油配成40%四氯化碳溶液。ALT、AST试剂盒(宁波亚太生物技术有限责任公司,批号: 20080616);Ⅰ型胶原、TGF-β1 ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司);一抗:即用型TGFβ1(BA0290)兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);二抗:即用型免疫组化MaxvisionTM抗兔-HRP检测试剂盒、DAB显色试剂盒(福建迈新公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 90只SD健康大鼠随机分为6组,每组15只,分别为正常组、模型组、秋水仙碱阳性对照组、给药组(高、中、低剂量)。除正常对照组外,其余各组大鼠于首次在背部皮下注射纯CCl45 ml/kg,以后皮下注射40% CCl4溶液2 ml/kg,每周注射2次,共10周。自造模之日起的第6周开始,用药组每天1次灌胃给Genistein (分为25、50和100 mg/kg组),阳性组灌胃给秋水仙碱(0.5 mg/kg)。至10周末取血清,处死大鼠留肝组织,肝组织经10%甲醛固定,做HE染色和免疫组化检测。

1.2.2 血清学指标的测定 大鼠取血后室温静置1 h, 3000 r/min离心15 min,分离血清。按试剂盒操作赖氏法检测ALT、AST, ELISA法检测TGF-β1和Ⅰ型胶原。

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1.2.3 病理学检查 肝组织经10%甲醛固定,石蜡包埋,做常规组织切片,HE染色,观察。

1.2.4 免疫组织化学检测TGF-β1表达 石蜡包埋常规组织切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精水化。然后将脱蜡水化后的组织切片放入已沸腾的柠檬酸缓冲液中进行酸化修复。取出玻片,先用自来水冲洗后,置放于卵育盒中。PBS冲洗3次,每次间隔3 min,除去PBS液。每张切片加1滴3%过氧化氢,室温下孵育10 min。PBS冲洗3次,每次间隔3 min,除去PBS液。每张切片加50μl的TGFβ1兔抗大鼠多克隆抗体,在4℃温度下孵育过夜。PBS冲洗3次,每次间隔3 min。除去PBS液,每张切片加50μl MaxvisionTM抗兔-HRP检测试剂盒,室温下孵育15 min。PBS冲洗3次,每次间隔3 min,除去PBS液。每张切片加50μl新鲜配制的DAB溶液显色观察。自来水冲洗,苏木素复染30 s,自来水冲洗,返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥、中性树胶封固。在OLYMPUS倒置金相显微镜(GX51)的全自动图像分析系统上,每张切片随机选取10个视野(×100倍)测定阳性细胞面积百分比(阳性着色面积百分比=阳性着色面积/肝组织面积×100%),平均值越大表明组织中该抗原含量越高,据此分析TGF-β1的表达。

1.2.5 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据均以x±s表示,组间比较采用t检验, 以P

2 结果

2.1 Genistein对CCl4诱导的模型大鼠血清ALT、AST、TGF-β1和Ⅰ型胶原的影响结果见表1。 与正常组相比, 肝纤维化模型大鼠血清ALT、AST、TGF-β1和Ⅰ型胶原明显升高(P

表1

Genistein对CCl4诱导的模型大鼠血清ALT、AST、TGF-β1和Ⅰ型胶原的影响(n=10,x±s)

组别剂量(mg/kg)ALT(U/L)AST(U/L)TGF-β1(ng/L)Ⅰ型胶原(μg/L)

对照-42.3±6.559.7±7.4658.1±77.333.6±5.7

模型-146.4±11.6a112.3±13.9a875.2±101.3a89.4±10.1a

秋水仙碱0.5104.5±8.2b88.2±6.7b726.7±94.7b67.3±8.7b

Genistein25139.8±9.5107.6±10.5838.5±89.282.7±9.2

Genistein 50118.4±12.2b94.8±8.1b751.2±95.9b70.8±10.2b

Genistein 100112.2±10.8b90.3±8.3b732.8±110.4b65.3±8.4b

注:aP

2.2 Genistein对CCl4诱导的模型大鼠肝组织病理的影响 HE染色后观察(图1), 正常组肝小叶结构完整, 中央静脉及静脉窦状隙无扩张,肝细胞排列整齐, 无变性及硬化; 模型组大鼠肝细胞高或中度浊肿变性,大小不等的圆形或椭圆形肝细胞结构结节构成的假小叶形成,结节周围纤维组织沉积、增生。Genistein治疗组和秋水仙碱组大鼠纤维程度均有不同程度减轻, 肝小叶结构基本完整,少量肝细胞轻度浊肿,汇管区少量纤维组织增生,纤维间隔变窄,炎脂肪空泡的形成明显降低。

图1 Genistein对CCl4诱导的模型大鼠肝组织病理学HE染色结果(×100)

A正常组; B模型组; C秋水仙碱阳性对照组; D(Genistein 25 mg/kg); E(Genistein 50 mg/kg); F(Genistein 100 mg/kg)

表2

Genistein对CCl4诱导的模型大鼠肝组织TGF-β1表达的影响(n=10,x±s)

组别剂量(mg/kg)TGF-β1(%)

对照-0.82±0.31

模型-2.06±0.36a

秋水仙碱0.51.21±0.23b

Genistein251.38±0.51 b

Genistein 501.29±0.27b

Genistein 1001.22±0.45b

注:a P

2.3 Genistein对CCl4诱导的模型大鼠肝组织TGF-β1表达的影响 按“1.2 4”中的方法定量分析各组肝组织中TGF-β1表达,正常对照组中的大鼠肝组织仅在中央静脉和汇管区有少量浅淡着色,TGF-β1仅微量表达;模型组中大量阳性染色分布于变性的肝细胞、中央小叶和门静脉周围纤维带及肝纤维间隔,TGF-β1阳性表达显著增强(P

图2 Genistein对CCl4诱导的模型大鼠肝组织中的TGF-β1免疫组化结果(×100)

A正常组; B模型组; C秋水仙碱阳性对照组; D(Genistein 25 mg/kg); E(Genistein 50 mg/kg); F(Genistein 100 mg/kg)

3 讨论

目前认为ECM的过度增多和异常沉积是肝纤维化的主要发生机制[5～7]。 在正常肝脏组织中存在着ECM的合成与降解的动态平衡,肝纤维化时纤维结缔组织的形成,是由于各种不同致病因子导致ECM合成与降解的失衡而在肝内过量沉积所致。研究表明, ECM的合成与降解在很大程度上由TGF-β1调控,TGF-β1是强有力的致纤维化细胞因子,在肝纤维化中表达明显增多,能够抑制肝细胞增殖、诱导肝细胞凋亡,促进HSC的增殖和活化,使肝细胞外基质ECM成分合成增多,降解减少,并存在正反馈放大效应,促进肝纤维化的进程[8～11]。现已证实肝纤维化发生的关键是HSC的激活及其激活后ECM异常表达,TGFβ1是激活HSC并促进其表达ECM的关键因子, 在促进ECM合成、抑制ECM降解等多环节发挥重要作用[8]。

国内外的血清学-组织学的研究表明, 外周血TGF-β1水平可反映慢性肝病纤维化中组织炎症坏死及纤维化程度[12],因此检测外周血和肝组织中的TGF-β1表达情况对肝纤维化的检测具有重要意义。本实验研究表明, Genistein能显著降低肝纤维化模型大鼠外周血和组织中的TGF-β1表达水平, 这一结果提示Genistein对TGF-β1的抑制可能是其治疗肝纤维化的机制之一。

参 考 文 献

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