HPLC法测定药典方丹参片中丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量

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[摘要] 目的：完善药典方丹参片的质量标准，测定制剂中丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量，考察制备工艺中有效成分的转移率。方法：采用hplc法进行含量测定。丹参酮ⅡA，以甲醇-水（80∶20）为流动相，检测波长为270 nm；丹酚酸B以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)，检测波长为286 nm。结果：3批丹参片平均含丹参酮ⅡA 2.83 mg/g，转移率为42.3%；丹酚酸B含量为 51.8 mg/g，转移率为50.9%。结论：建立了丹参片中丹参酮ⅡA的含量测定方法，可以更好地控制丹参片的质量。

[关键词] 丹参片；丹参酮ⅡA；丹酚酸B；HPLC

[中图分类号]R917 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）08（b）-030-03

Quantitative determination of tanshinoneⅡA and salvianolic acid B in pharmacopoeial prescription Danshen Tablets by HPLC

LIU Tao

(Center for Certification and Evaluation, Shanghai Food and Drug Administration, Shanghai 200020, China)

[Abstract] Objective: To determine tanshinoneⅡA and salvianolic acid B in Danshen Tablets quantitatively. Methods: HPLC with Hypersil ODS column was used in the content determination. For tanshinoneⅡA , the mobile phase was composed of methanol-water (80∶20) and the detective wavelength was at 270 nm. For salvianolic acid B, the mobile phase was composed of methanol-acetonitrile-formic acid-water (30∶10∶1∶59) and the detective wavelength was at 286 nm. Results: The average contents of tanshinoneⅡA and salvianolic acid B in three batch of tablets were 2.83 mg/g and 51.8 mg/g respectively. The extraction rate of the preparation processes were 42.3% and 50.9% respectively. Conclusion: The method is available with a good reproducibility and can control the quality of Danshen Tablets effectively.

[Key words] Danshen Tablets；TanshinoneⅡA；Salvianolic acid B；HPLC

丹参片为《中国药典》2005版一部收载的成方制剂，是单味丹参提取制得的片剂，功能活血化瘀，主要用于冠心病心绞痛等疾病[1]。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根及根茎，同时含有脂溶性和水溶性两大类活性成分。丹参脂溶性成分大多为共轭醌、酮类化合物，具有特征的橙黄色和橙红色，代表性成分有丹酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮等；水溶性成分主要为酚酸类物质，代表性成分有丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、丹酚酸A、丹酚酸B等[2]。

《中国药典》2005版一部中，丹药材项下已规定同时测定丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量来控制丹参药材的质量，但丹参片中并未收载丹参酮ⅡA的含量测定方法[1]。为更好地控制丹参片的质量，本文建立测定丹参片中丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量，并探讨制备工艺对两种成分转移率的影响。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（Aglient 1100，Aglient Technologies），HYPERSIL C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（大连依利特科学仪器有限公司）。

丹参酮ⅡA对照品（110766-200315）、丹酚酸B对照品（111562-200302），均购于中国药品生物制品检定所；丹参药材（购于上海雷允上药业西区有限公司），按《中国药典》2005版一部检验为合格药材。

甲醇、乙腈为色谱纯；重蒸水（自制）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 丹参片的制备

按《中国药典》2005版一部丹参片项下的制备方法，制备三批小试样品，批号分别为20080311、20080315、20080317 。制法如下：

取丹参1 000 g，加90%乙醇回流1.5 h，滤过，滤液回收乙醇；药渣加水煎煮1 h，滤过；合并上述滤液，减压浓缩至相对密度为1.30 (90℃)的浸膏，加淀粉适量，混匀，减压干燥（温度55℃，真空度

2.2 丹参酮ⅡA含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水（80∶20）为流动相；检测波长为270 nm。在上述色谱条件下丹参酮ⅡA与其他组分达到基线分离，与相邻的色谱峰分离度大于1.5，阴性对照无干扰（图1）。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于2 000。

2.2.2 供试品溶液的制备取本品10片，糖衣片除去糖衣，精密称定，研细，取0.5 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理15 min(250 W，50 kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备取丹参片制备过程中的辅料淀粉约0.5 g，精密称定，按“2.2.2”项下的制备方法同法制备，取续滤液，即得阴性对照溶液。

2.2.4 线性关系考察取丹参酮ⅡA对照品10 mg，精密称定，置50 ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。以此为母液，依次稀释，分别配制成12.62 ~202 μg/ml的一系列浓度梯度的对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液各10 μl，按上述色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标，丹参酮ⅡA进样量为横坐标，得回归方程为：Y=2 927.23X+21.56，r=0.999 7。结果表明，丹参酮ⅡA进样量在0.126 2 ~2.02 μg范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验精密吸取丹参酮ⅡA进样量对照品溶液重复进样5次，测得丹参酮ⅡA峰面积的RSD为1.1%。

2.2.6 重复性试验取批号为20080311的丹参片，平行取样品6份，精密称定，照“2.2.2”项下方法处理，在给定的色谱条件下进行测定，丹参酮ⅡA含量测定的RSD为1.3%。

2.2.7 加样回收率试验取批号为20080311的丹参片（丹参酮ⅡA含量为2.84 mg/g），按表1分别加入一定量的标准品后，按拟定的方法处理并测定含量，计算回收率。

表1 丹参酮ⅡA加样回收率试验结果

2.3 丹酚酸B含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)；流速：1 ml/min；检测波长：286 nm.

在上述色谱条件下丹酚酸B与其他组分达到基线分离，与相邻的色谱峰分离度大于1.5，阴性对照无干扰（图2）。理论塔板数按丹酚酸B峰计算应不低于2 000。

2.3.2 供试品溶液的制备取本品10片，除去糖衣，精密称定，研细，取约0.1 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加水适量，超声处理(250 W，50 kHz) 20 min，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液1 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 阴性对照溶液的制备取丹参片制备丹参片制备过程中的辅料淀粉约0.1 g，精密称定，按“2.3.2”项下方法同法制备，取续滤液，即得阴性对照溶液。

2.3.4 线性关系考察精密称取丹酚酸B对照品适量，加水制成每1 ml含0.14 mg的溶液，即得。以此为母液，依次稀释，分别配制成0.008 75~0.14 mg/ml的一系列浓度梯度的对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液各10 μl，按上述的色谱条件进行测定。以峰面积积分值为纵坐标Y，丹酚酸B对照品的进样量为横坐标X（mg/ml），计算得回归方程：Y= 1 138.8X-8.721，r=0.999 98。结果表明，丹酚酸B浓度在0.087 5~1.4 μg范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验精密吸取丹酚酸B对照品溶液重复进样5次，测得丹酚酸B的峰面积RSD为1.06%。

2.3.6 重复性试验取批号为20080311的丹参片，平行取样品6份，精密称定，照“2.3.2”项下方法处理，在给定的色谱条件下进行测定，丹酚酸B含量测定的RSD为1.43%。

2.3.7 加样回收率试验取批号为20080311的丹参片（丹酚酸B含量为52.7 mg/g），按表2分别加入一定量的标准品后，按拟定的方法处理并测定含量，计算回收率。

表2丹酚酸B加样回收率试验结果

2.4 含量测定

分别取3批丹参片，分别按“2.2.2”、“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在给定的色谱条件下进行测定，以外标法计算丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量。结果见表3，丹参酮ⅡA的平均含量为2.83 mg/g，丹酚酸B的平均含量为51.8 mg/g。

3 讨论

《中国药典》2005版一部中丹参片项下未收载丹参酮ⅡA的含量测定方法。本文同时测定了丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量，可以更好地控制制剂的质量，也为中国药典丹参片质量标准的修订提供了实验依据。

丹参酮ⅡA含量测定中，供试品溶液的制备时考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇不同提取溶剂，以及溶剂用量、提取时间对丹参酮ⅡA提取率的影响，结果条件优选为甲醇25 ml，称定重量，超声处理15 min。

由于市场上丹参药材的合格率不高[3]，在探讨制备工艺对两种成分的转移率的影响时必需选用合格药材进行工艺研究。本文所采用的丹参药材含丹参酮ⅡA 0.201%、丹酚酸B 3.05%（未扣除水分）。相应计算出实验所制备的三批丹参片中丹参酮ⅡA 的平均转移率为42.3%、丹酚酸B为 50.9%。研究结果说明，目前所采用的工艺基本合理。

研究中发现，浓缩、干燥时的温度对片剂中丹参酮ⅡA很大。特别是，随着干燥温度的升高，丹参酮ⅡA的损失严重。这可能也是目前丹参片质量标准中不进行含量测定的原因之一。提示丹参片的制备工艺中要对干燥条件深入研究，尽量降低干燥温度或采取其他适用于热不稳定成分的干燥方法。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部. 北京: 化学工业出版社，2005.394.

[2]李文拮，王勇，姚世芳.丹参药用成分研究进展[J]. 人民军医，2008，51（3）：180-184.

[3]翟宏焱，刘军玲. 2005年全国丹参饮片专项考核分析[J].安徽医药，2008，12(2)：134-135.

（收稿日期：2008-07-09）

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