地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对脐橙溃疡病的作用机理与控病研究

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摘 要： 系统研究了地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对溃疡病病菌生长的影响，对其拮抗因子几丁质酶及β-1，3葡聚糖酶活性进行分析，进而进行了其离体果控病试验及田间防治试验。结果表明，有益微生物地衣芽孢杆菌复配苯噻酮对脐橙溃疡病有明显的抑菌作用，可造成溃疡病菌菌丝中空、扭曲、破损，地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株可以分泌几丁质酶及β-1，3葡聚糖酶抑制病菌生长，在发病前或发病初期喷布地衣芽孢杆菌复配苯噻酮对脐橙溃疡病有较好的防治作用。

关键词： 脐橙溃疡病；地衣芽孢杆菌；苯噻酮；作用机理；控病

脐橙溃疡病是脐橙生产上的重要病害，目前多采用化学农药进行防治，化学农药使用量越来越大，农药残留有加重的趋势[1]。利用有益微生物来调控该病，可减少防治脐橙溃疡病的化学农药使用量，降低农药污染，改善环境，提高脐橙产品质量[2]。开展有益微生物的抑菌作用机理与控病研究可为地衣芽孢杆菌复配苯噻酮的产业化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

脐橙溃疡病病菌为本研究室保存。地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株发酵液制备：将本研究室保存的地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株悬液接种到NA培养液中，摇瓶发酵培养3d，保存备用。

1.2 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对溃疡病病菌生长的影响

1.2.1 试验设计。试验设4种处理方法：①将溃疡病病菌孢子接种到装有5ml复配苯噻酮的地衣芽孢杆菌溶液的试管中，空白对照是含葡萄糖的无菌水，置于28℃下培养3d，显微镜下观察病菌生长状况。②用接种针分别挑取地衣芽孢杆菌复配苯噻酮和溃疡病病菌菌碟放到NA培养基上，进行对峙试验，在28℃下培养4d后观察结果。③挑取沾有地衣芽孢杆菌发酵液复配苯噻酮的纸碟放到含有溃疡病菌的NA培养基上，28℃下培养4d后观察抑菌结果。④将地衣芽孢杆菌菌株发酵液放到高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌20min，灭活后的菌株采用和②相同的处理方法。

1.2.2 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对溃疡病病菌生长作用的显微观察。取地衣芽孢杆菌复配苯噻酮和溃疡病菌对峙试验交合处，用双面胶带粘样，用IB-5型离子溅射仪喷镀，厚度为200A，在日立S-450扫描电子显微镜下观察并照相。

1.3 地衣芽孢杆菌发酵液复配苯噻酮拮抗因子分析

1.3.1 酶粗提液制备。挑取保存的地衣芽孢杆菌菌株在NA平板上活化培养3d，用10ml无菌水洗下制成菌悬液，取500μl菌悬液接种于无菌的 NA液体培养中，28℃下150r/min震荡培养。分别于接种培养后的1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d取样，将样品在10000r/min下4℃离心20min，取上清液为酶粗提液，4℃保存备用。

1.3.2 N-乙酰氨基葡萄糖胺标准曲线测定。将500μg/ml的N-乙酰氨基葡萄糖胺准确稀释至100μg/ml，用此溶液再稀释成不同浓度（起始浓度为0μg/ml）。然后取几支干净试管，分别加入不同浓度的N-乙酰葡萄糖胺溶液1.5ml、高铁氰化钾溶液2ml，置于100℃水浴中15min，冷却，于420nm处以蒸馏水为空白对照读取光密度值。光密度值的下降与糖浓度成反比。以光密度为纵坐标，N-乙酰葡萄糖胺浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.3 几丁质酶活性。参照Boller等方法[1]，将几丁质用稀盐酸溶解，再以碱溶液中和，最后用0.1M醋酸钠缓冲液（pH=5.2）定容。取定量的酶粗提液与底物溶液混合，在37℃条件下恒温水浴反应2h。反应结束后，10000rpm离心5min，取上清液0.5ml，加入3%蜗牛酶2ml和pH值7.1的磷酸钠缓冲液，37℃水浴1h，加100μl四硼酸钾（pH=9.1），煮沸3min，冷却后加入2ml DMAB，37℃保温20min，立即冷却，在585nm下测OD值。以N-乙酰葡萄糖胺作标准曲线。以每小时分解几丁质产生1μg的N-乙酰葡萄糖胺的酶量为一个酶活单位（U）。

1.3.4 标准还原糖曲线制作。将500μg/ml的葡萄糖溶液准确稀释成不同浓度的葡萄糖溶液，然后取干净试管分别加入不同浓度的葡萄糖溶液0.5ml，加入0.5ml铜制剂，置于沸水浴中10min，之后用自来水冷却。加入0.5ml砷钼酸试剂，混匀，再加入3.5ml蒸馏水，在分光光度计660nm处测定光密度值，以光密度值为横坐标、葡萄糖浓度值为纵坐标制作标准曲线。

1.3.5 β-1，3葡聚糖酶活性测定。取定量的酶粗提液，用DNS法测定所形成的还原糖量，以每秒产生还原糖1μmol的酶量为一个酶活单位（U）。

1.4 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮的离体果控病试验

在田间选取大小、成熟度基本一致的脐橙果实，按下述3种方式处理：①先喷布1×108个/ml的地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌悬液200倍，24h后刺伤接种溃疡病菌1×106个/ml的孢子悬液。②先喷布溃疡病菌1×106个/ml孢子悬液，24h后刺伤喷布1×108个/ml的地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌悬液200倍。③先喷无菌水，24h后刺伤接种溃疡病菌1×106个/ml孢子悬液（对照）。以上处理每个果面刺伤3处，28℃下保温、保湿，5d后观察刺伤点发病情况，计算防治效果。

防治效果（%）=（对照区刺伤点发病率-处理区刺伤点发病率）/对照区刺伤点发病率×100

1.5 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株田间防治试验

在脐橙成熟期进行以下处理：①先喷布地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌悬液（1×108个/ml）200倍液，一天后接种溃疡病菌孢子悬液（1×106个/ml）。②先接种溃疡病菌孢子悬液（1×106个/ml），一天后接种地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌悬液（1×108个/ml）200倍液。③先喷清水（对照），1天后接种溃疡病菌孢子悬液（1×106个/ml）。以上处理保湿48h，6d后调查病穗数，计算发病率和防治效果。试验共设3个处理，每处理重复3次，每个重复取10株。

防治效果（%）=（对照区发病率-处理区发病率）/对照区刺伤点发病率×100

2 结果与分析

2.1 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株的作用机理

地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对溃疡病菌的影响。将溃疡病病菌放到复配苯噻酮的地衣芽孢杆菌发酵液中，菌丝和孢子均不能正常生长。病菌平板对峙试验结果显示，地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株有明显的抑菌作用（图1），并且随着培养时间延长，地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株继续生长，能够进入溃疡病菌中，破坏菌体。从地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株和病菌交合处的扫描电镜（图2）看，溃疡病菌菌丝遭到严重破坏，中空、扭曲、破损，在菌丝中有的可看到地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株，说明地衣芽孢杆菌复配苯噻酮具有重寄生作用。灭活后的地衣芽孢杆菌发酵液复配苯噻酮对溃疡病菌也有抑制作用，说明地衣芽孢杆菌复配苯噻酮杀菌剂的溶液中含有抑制病菌的拮抗物质。

2.2 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮发酵液的拮抗因子分析

2.2.1 几丁质酶活性。从不同培养时间测出的地衣芽孢杆菌发酵液几丁质酶活性看出（图3），地衣芽孢杆菌菌株经过发酵后，可产生几丁质酶。其特点是培养1d后几丁质酶活性达到了较高活性，第2d达到最高，以后几丁质酶活性缓慢下降。

2.2.2 β-1，3葡聚糖酶活性。从不同培养时间测出的β-1，3葡聚糖酶活性（图4）看出，地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株经过发酵后，可产生β-1，3葡聚糖酶。其特点是：培养2d后β-1，3葡聚糖酶活性几乎达到了最高活性，第4d比第1d略高，随着培养时间加长，β-1，3葡聚糖酶活性缓慢下降。

2.3 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株的控病试验

2.3.1 离体果地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株防治脐橙溃疡病试验。试验结果表明（见表1），先喷施地衣芽孢杆菌菌液复配苯噻酮再接种溃疡病菌的防治效果为73.8%，而先接种溃疡病菌后再接种地衣芽孢杆菌菌液复配苯噻酮的防治效果为63.6%，前者防效明显高于后者，说明先接种地衣芽孢杆菌菌液复配苯噻酮可优先利用伤口的外渗营养，阻止病菌孢子的侵入，并可杀死病菌，从而达到防治病害的目的。

2.3.2 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮田间菌株防治脐橙溃疡病试验。结果表明（见表2），先喷地衣芽孢杆菌复配苯噻酮后接种溃疡病菌和先接种溃疡病菌后喷地衣芽孢杆菌复配苯噻酮，这2种处理防治效果有较大不同。先喷施地衣芽孢杆菌菌液复配苯噻酮后接种溃疡病菌果穗发病率为15%，防效为74.2%；而先接种溃疡病菌后喷地衣芽孢杆菌菌液复配苯噻酮果穗发病率为25%，防治效果为65.6%，前者防效明显好于后者。

3 结论与讨论

3.1 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株的拮抗作用

将溃疡病菌放到地衣芽孢杆菌发酵液复配苯噻酮中，菌丝和孢子不能正常生长。通过病菌平板对峙试验，证明地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对溃疡病菌有明显的抑菌作用，并且地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株能够进入溃疡病菌中，破坏病菌，造成溃疡病菌菌丝中空、扭曲、破损，灭活后地衣芽孢杆菌菌株发酵液复配苯噻酮存在拮抗物质，能够抑制病菌生长，说明地衣芽孢杆菌复配苯噻酮对溃疡病菌具有重寄生作用。

3.2 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株防效评价

不管在离体果条件下，还是在田间防治脐橙溃疡病试验中，地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对脐橙溃疡病均有较好的防治效果。刺伤接种可加速脐橙溃疡病的发生，先喷施地衣芽孢杆菌菌液复配苯噻酮再接种溃疡病菌的防治效果，好于先接种溃疡病菌再接种地衣芽孢杆菌菌液复配苯噻酮，因此，应用地衣芽孢杆菌菌液复配苯噻酮防治该病，应当在发病前或发病初期进行为宜。先接种地衣芽孢杆菌菌液复配苯噻酮可优先利用伤口的外渗营养，可阻止病菌孢子的侵入，并可杀死病菌，达到防治病害的目的。这一结果为制定防治该病措施提供了科学依据。（收稿：2013-02-04）

参考文献：

[1] 戴文娟，关凌云. 脐橙溃疡病的发生规律与防治措施[J]. 现代农业科技， 2010， 8： 196

[2] 刘冰. 赣南脐橙溃疡病及其研究现状[J].生物灾害科学， 2012， 35（3）： 235-238

[3] Boller T， Gehria A ， Mauch F， et al. Chitinase in bean leaves： induction by ethylene， purification， and possible function， Planta， 1983， 157（1）： 22-31