药物分析中应用高效液相色谱法若干问题研究

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【中图分类号】R917【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2011)08－0350－01

【摘要】高效液相色谱法是药物分析与检验中应用最广泛的方法之一，它具有分离效能高、灵敏度高、分析速度快和应用范围广等优点。本文对药物分析与检验中应用高效液相色谱法时实际操作中的一些问题进行了研究和探讨。

【关键词】高效液相色谱法；药物分析；应用

目前高效液相色谱法（HPLC）在药物分析中的应用越来越广，对挥发性低、热稳定性差和相对分子质量大的药物的分离测定尤为有利。高效液相色谱同其他的色谱一样，都是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的分配过程，是借不同组分在两相间亲和力、吸附能力、离子交换或分子排阻作用等的差异进行分离。

一 HPLC方法的建立

应用HPLC对样品进行分离、分析，主要根据样品的性质选择合适的分离类型及所用的色谱柱和流动相、检测器等。样品中待测组分的相对分子质量大小、化学结构、溶解性等化学、物理性质决定着色谱分离类型的选择。如果样品是复杂的混合物，需要柱效高的色谱柱，也可考虑梯度洗脱。若只需测定混合物中一个或两个组分或测定反应原料与产物的情况时，可选用较简单的方法，只要待测组分能分开即可，不必将所有组分都分开。原料药常需要很纯，需将所有组分分开，即主药物、中间体、杂质和降解产物的峰都应分开。纯度范围窄的，方法的精密度必须足够好，通常重复测定的相对标准偏差应低于2%。如果分析复方制剂，应考虑赋形剂和降解产物的干扰。如果测定的药品中有微量杂质存在，而且此杂质有毒性或副作用，则必须提高方法的灵敏度，以区分少量杂质与噪音，此时色谱柱和溶剂条件必须允许大量样品的进样。在选择色谱条件时，还应考虑样品的稳定性，如果某些条件能使待测组分分解，则须避免使用此条件。

HPLC的各种方法有其各自的特点和应用范围，应根据分离分析的目的、样品的性质和含量、现有的设备条件等选择合适的方法。通常分离类型应根据样品的性质来选择，并据此选择色谱柱和流动相。在分析HPLC中，流动相的种类、配比对色谱分离效果影响很大，而可供选择的固定相填料种类较少，因此流动相的选择非常重要。

二 溶剂的处理

溶剂的纯度及溶在其中的气体常是液相色谱工作问题的来源，事先必须严格处理，以保证工作的顺利进行。在HPLC分离测定中，溶剂的纯度是很关键的，溶剂足够纯才不至于产生问题，对溶剂纯度的要求依应用情况而定。为避免色谱分析工作问题的发生，应使用光谱纯或色谱纯溶剂，但考虑价格等因素，使用较低纯度溶剂或易被氧化分解等溶剂时，则应将溶剂进行纯化。水的纯化可通过滤过、反渗透、去离子、蒸馏、电解或这些技术相结合来实现，要求水中不能含有所用检测器能检测到的杂质。有机溶剂可通过蒸馏或色谱方法纯化，如非极性溶剂可先用浓硫酸洗，以除去碱性杂质。

液相色谱仪的检测器常被溶剂中的气泡干扰，气泡的形成是由于被空气饱和的溶剂从高压流向低压，如柱出口，这些气泡形成干扰检测器光学通路的折射表面，非极性溶剂（如己烷）可被溶解在溶剂中的氧“淬灭”而降低荧光，色谱柱的性能也受气泡影响，在流动相中的氧也会与某些柱填料反应，如氧与烷基胺反应。

磷酸盐、乙酸盐缓冲液是霉菌生长的很好基质，这会堵塞色谱柱和系统，通常为避免霉菌生长，尽量使用新配的缓冲溶液，必要时可放在冰箱中贮存。另外贮液器应定期用酸、水清洗，特别是盛水和缓冲液的瓶子，易发霉，因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。

三 系统适用性试验

当用HPLC方法时，系统要有合适的性能，系统性能受所用的色谱柱和溶剂的影响。通常用分离度、理论塔板数和峰拖尾因子等几个基本参数来测定系统性能。分离度用于评价至少含有两个化合物的样品的测定，用样品中分离最差的两个组分的分离度来评价，其中之一应是主要待测物，此时应规定最小的分离度，并在测定前予以满足，通常R＞1.5否则此数据不可靠。在药物分析中，分离度并不容易测得，因分离度的测定需要有与主要待测组分相近量的第二个化合物而许多药物制剂中没有较大量的另种化合物（杂质或降解产物）。为克服此问题，可用一参比样品，例如在甲氨喋呤的测定中，要加入叶酸测其分离度，规定甲氨喋呤与叶酸的分离度R＞8.0。引进第2个化合物的另一种方法是加入某一种与样品中待测组分有合适分离度的物质，内标物即可用于此目的。峰拖尾程度对柱死体积和柱填料的变化很敏感，可作为衡量柱能否再用的标准。总之，柱性能是否处于良好水平，可使用关键的参数（如校正线的斜率、理论塔板数和峰拖尾程度）来衡量。当这些参数已超出允许的范围时，就不应再用此柱进行实验。

四 HPLC仪器的使用

仪器在使用中出现的故障或不正常现象多数情况是由于操作不当引起的，而且可能是一个也可能是多个原因造成，必须先找出原因，才能尽快排除故障，使仪器正常工作。色谱仪的使用寿命通常为10～20年。限制仪器使用寿命的是组件本身有一定的工作寿命，这意味着仪器的故障随时间而增加，有时故障出现非常频繁，以至于仪器变得不可靠或不值得维修。仪器的寿命可由于精心使用和保养而延长。

HPLC的检测器是光学通路，溶剂中一些外来物质都引起检测器的响应，因此用在溶剂通路的管子都必须在用前清洗。紫外检测池应清洁，应避免外来物和残留液的膜迹，可用硝酸清洗样品池和参比池如果池子太脏且其他方法都解决不了时，就必须拆下，清洗后再装上。如果拆下清洗，应注意有些部件不能在硝酸中清洗。此外，仪器使用前应仔细阅读仪器说明书，应保持系统和周围环境的清洁。由于压缩液体，尤其有机溶剂对人和仪器有潜在的危险，遵守下列操作注意事项，可安全操作并能减少仪器的维修。

参考文献

［1］ 周如梅. 高效液相色谱及其应用［J］.企业技术开发, 2005, (06) .

［2］ 凌大奎. 有关物质及其高效液相色谱法［J］ .中国药学杂志, 2000, (08) .

作者单位：210038 南京新百药业有限公司（江苏 南京 ）