微波辅助提取虎杖中白藜芦醇的工艺研究

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【摘 要】 目的：优选微波辅助提取虎杖中白藜芦醇的最佳工艺。方法：用紫外分光光度法测定白藜芦醇的含量，并以白藜芦醇的提取率为参考指标，通过单因素实验及正交实验方法对微波辅助提取法（MAE）提取虎杖中白藜芦醇的最佳工艺进行研究。结果：经过正交实验得到从虎杖白藜芦醇的最佳工艺为：微波辅助作用时间15 min以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W。结论：该实验确定的最佳提取工艺简便、快速、准确，灵敏度高和重现性好等优点。

【关键词】 虎杖 白藜芦醇 微波辅助提取 正交实验 紫外分光光度法

虎杖别名花斑竹、酸筒杆、酸桶笋、酸汤梗、川筋龙、斑杖根，为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum，的干燥根茎和根。多生于山谷、溪旁或岸边，分布在我国中部及南部。产于江西、福建、云南、四川、贵州等地。药理作用：（1）对心血管系统的影响：强心扩血管作用；抑制血小板聚集、抗血栓；改善微循环、抗休克作用；降血脂；（2）对呼吸系统的影响：镇咳、平喘作用；（3）对消化系统的影响：胃肠道作用、保肝用；（4）止血抗炎作用；（5）镇静作用；（6）修复损伤的DNA及保护大脑皮层神经元功能、对酶活性抑制作用、对内分泌的影响、对基因表达的影响、利尿作用等[1]。研究结果表明虎杖含有如下多种化学成分：含有大黄素、大黄素-6-甲醚、大黄素-8-单甲醚、大黄酚、大黄酸及蒽苷大黄素-6-甲醚-8-β-D-葡萄糖苷和大黄素-8-β-D-葡萄糖苷等[2]；含有白藜芦醇和白藜芦醇苷（虎杖苷）.其中白藜芦醇和白藜芦醇苷为主要药用成分。白藜芦醇（3，4，5，-三羟基二苯乙烯；trans-resveratrol）是一种活性多酚物质，在虎杖、葡萄、花生、毛穗藜芦、毛脉酸模等植物中存在[3]。白藜芦醇的功能作用：首先，具有抗癌作用，可用于预防与治疗慢性炎症和癌症。对肿瘤的起始、促进、发展三个阶段均有抑制作用，可作为天然的化学防癌剂。其次，在心血管方面的作用。适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的观点已得到普遍认同。另外，白藜芦醇还具有抗氧化、抗自由基，保护肝脏，抗菌，消炎，抗过敏等多种有益人体的功能作用[4]。目前，国内在白黎芦醇的提取方面研究较多。一般是采用有机溶剂提取，如乙醇、甲醇、丙酮等，以丙酮提取率最高。提取方式有浸渍提取、回流提取、超声提取等，硅胶柱层析或大孔吸附树脂吸附分离的方法来提纯白黎芦醇；检测多以高效液相色谱。本实验以微波辅助提取，具有省时、方便等作用，微波辅助提取中药有效成分具有选择性好、提取纯度高和高效快速的特点，已在中草药化学成分提取方面得到广泛应用。 有关虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷和大黄素含量测定方法的研究报道较多，主要有分光光度法、胶束薄层色谱法、电化学发光法、高速逆流色谱法、高效液相色谱等[5-6]，其中以分光光度法最为简单方便。本研究探讨微波辅助提取虎杖中白藜芦醇的工艺研究，并建立测定白藜芦醇含量的紫外分光光度法，旨在为虎杖的药理作用研究以及科学合理利用提供试验依据。

1 实验部分

1.1 原料、试剂与仪器

（1）实验原料、试剂；虎杖，产地：福建三明； 95%乙醇；乙酸乙酯；石油醚；均为化学纯；白藜芦醇，产地：美国，分析纯。（2）实验仪器；TR-02型药材粉碎机：（武义县屹立工具有限公司）；LWMC-205型可调功率微波化学反应器 ：（南京陵江科技开发有限责任公司）；SHB-III循环水式多用真空泵：（郑州长城科工贸有限公司）；UV-2550型紫外分光光度计：（厦门精艺兴业科技有限公司）；FA1604N型电子天平：（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52B旋转蒸发仪：（上海博经经贸公司）；SYP智能型玻璃恒温水浴锅：（巩义市予华仪器责任有限公司）；玻璃仪器气流烘干器：（巩义市予华仪器责任有限公司）722S-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司。

1.2 分析方法

本方法采用紫外分光光度计在306.4nm出测量所提取液的吸光度。一定的波长下有吸收峰进行测定。白藜芦醇的英文名Resveratrol简写RES，分子式C14H12O3，分子量228.25，无味、白色晶体难溶于水，易溶于乙醇，甲醇，丙酮等有机溶剂，本实验以白藜芦醇为对照品，以乙醇为溶剂，采用分光光度法在306.4nm波长下直接进行白藜芦醇吸光度值的测定，从而分析计算其含量。

1.3 实验步骤

（1）备料；把虎杖根茎烘干、把干净的虎杖用粉碎机粉碎，过40目筛后放存储瓶中备用。（2）配制溶液；分别配制45%、55%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液：乙酸乙酯：水为1：1的溶液。（3）供试品溶液制备；按照实验方案准确称取1.0g若干份虎杖根茎粉末，分别置于三角锥形瓶中，加入相应浓度和体积的乙醇浸泡6小时，置于微波化学反应器中按方案提供的条件提取，冷却室温后抽滤；加石油醚洗涤至上层清液为无色，滤液再用乙酸乙酯：水为1：1的溶液萃取3次（每次所用溶液为20ml），将萃取液转入旋转回流蒸发仪中，40℃水浴浓缩，样品浓缩后，至于50ml容量瓶中加95%乙醇至刻度，摇匀，分别取2ml至25ml容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试液备用。（4）微波辅助提取虎杖中白藜芦醇及测定的工艺流程；虎杖根茎干燥粉碎烘干过筛（40目）按料液比浸渍微波提取冷却石油醚洗涤1：1的乙酸乙酯：水溶液萃取旋转回流蒸发仪（40℃水浴）蒸发定容（50mL容量瓶）移取2.00mL定容（25mL容量瓶）测定吸光值分析计算提取率。

1.4 标准曲线的绘制

（1）对照品溶液的制备；准确称取白藜芦醇标准品10.00mg至50mL容量瓶中，用无水乙醇配成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。（2）最大吸收波长的选择；准确吸取对照品溶液0.3mL，置于10mL容量瓶中，加人95%乙醇定容，再取95%的乙醇溶液为空白对照液，及所制取的供试品溶液，将三种溶液用UV-2550型紫外分光光度计于波长为200——400nm范围进行扫描。结果表明：供试品溶液及对照品溶液均在波长306.4nm处有最大吸收峰，因此选择306.4nm为测定波长。（3）标准工作曲线：分别精确吸取0.2mg/mL的白藜芦醇对照品溶液0.0mL、0.15mL、0.3mL、0.45mL、0.6mL、0.75ml、0.9ml置于10ml容量瓶中定容，同时以95%乙醇试剂空白对照，在306.4nm处测定吸光度。以白藜芦醇标准溶液的浓度为横坐标，测定的吸光度为纵坐标，作图得到标准曲线，其回归方程为：Y=0.1614X+0.0682， R=0.9991。本品在3.0μg～18.0μg/ml范围内线性关系良好。结果见（图1）。

1.5 微波辅助波提取虎杖白藜芦醇的影响因素

微波时间：5—25min；微波功率：200W—600W；溶剂：不同浓度的乙醇（45%-80%）

料液比：1：15—1：35。

（1）微波辅助提取单因素实验；准确称取1.0g干燥的白藜芦醇根茎粉末，用不同微波时间、微波功率、乙醇浓度、料液比分别进行单因素实验。其中相同的提取条件分别是微波时间5min、微波功率400W、乙醇浓度70%、料液比1：25。（2）微波波提取正交优化实验设计；实际操作中各因素相互交叉影响，为了全面考察影响因素，在单因素的基础上，选取各单因素的较优条件，设计4因素3水平正交实验L9（34），确定白藜芦醇的最佳提取条件。

1.6 虎杖中白藜芦醇提取量的计算方法

白藜芦醇提取率：x（%）=（a×50×25/2m）/106

式中：x为样品中白藜芦醇的含量%；a为对应标准曲线上所对应的样品中白藜芦醇的质量（ug）；m为样品的质量（g）。

2 结果分析与讨论

2.1 虎杖中白藜芦醇提取的单因素实验

（1）料液比的选择；料液比即提取过程中原料与提取溶剂的比例（为便于换算，使用质量w/体积v）。料液比对提取过程的影响主要体现在相同的提取条件下，白藜芦醇等化合物的溶解度一定，此时若增大提取溶剂，则溶解的化合物的量也增大。理论上，在原料一定时，提取溶剂增大，三萜类化合物的浸出量增大；但提取溶剂并非能无限增大，若提取溶剂用量太大，一方面回收溶剂的成本增加，另一方面提取过程加热的能耗增加。为寻求最佳的料液比，本实验考察在70%乙醇﹣水体系，微波功率为400W、微波提取时间为5min，不同料液比条件下白藜芦醇的提取率，结果见图2所示。

（2）乙醇浓度的选择；白藜芦醇是多酚化合物，主要来源于蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根茎提取物。白藜芦醇为无味的白色晶体；难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。考虑到甲醇和丙酮的毒性和挥发性，所以本实验采用乙醇-水为溶剂，根据相似相容原理，调节乙醇水比例，使其极性与白藜芦醇相近，从而使得白藜芦醇在提取溶剂中达到最大溶解度。在乙醇﹣水体系下，微波功率为400W、微波提取时间为5min、料液比1∶25，三萜类化合物的提取率见图3。结果表明随乙醇体积分数的增大，提取率增大，浓度增大有利于增大白藜芦醇的溶解度，当达到一定程度时提取率不再增大，所以选择乙醇浓度70%为最佳浓度。

（3）微波提取时间的影响；白藜芦醇从虎杖的根茎中溶解到溶剂中是需要一定的时间，当破碎的细胞中的白藜芦醇溶于溶剂中后，采用微波直接作用于虎杖根茎分子，使细胞破裂是需要一定的时间，时间的长短可能决定着虎杖根茎细胞的破裂程度，从而影响虎杖中白藜芦醇的提取率。为寻找最佳微波提取时间，在微波功率为400W时，料液比1∶25，乙醇浓度70%的条件下，按不同微波提取时间进行提取实验，结果如（图4）。

（图4）表明提取率随时间的延长而增大，当提取时间到达15min后，随着微波时间的延长，提取率增大的不明显或已经停止增长，说明15min时提取率已经达到最大值，所以采取15min为最佳微波时间。

（4）微波功率的影响；粉碎至一定粒度后的药材，一部分虎杖根茎细胞可能会碎裂，其中所含的白藜芦醇可直接被溶剂萃取而转入溶剂中，溶剂与虎杖根茎粉末固体之间的浸泡过程，溶剂不断向固体内部扩散，在细胞内溶解白藜芦醇。当破碎的细胞中的白藜芦醇溶于溶剂中后，采用微波可直接作用于虎杖根茎分子，使分子的热运动加剧，从而引起温度升高，这种热效应可以快速破坏细胞壁，使虎杖中的白藜芦醇有效成分更快的分离提取出来，为寻找最佳微波功率，在微波时间为5min时，料液比1∶25，乙醇浓度70%的条件下，按不同微波功率进行提取实验，结果如（图5）。

（图5）表明提取率随微波功率而增大，但不是很明显，当达到500W时就已经达到了最大提取率，为节约能源的消耗，只需取500W就为最佳提取功率。

2.2 微波辅助波提取虎杖白藜芦醇的正交优化

（1）因素水平；试验选择以下4个因素：微波时间（A）、微波功率（B）、乙醇浓度 （C）、料液比（D）作为考察对象，每个因素取3个水平（表1），以提取物中白藜芦醇含量为评价指标，采用L9（34）正交表进行正交试验设计。

（2）正交实验方案与结果（见表2）.

（3）极差分析；由（表2）的极差计算结果得出，影响虎杖白藜芦醇提取率的因素主次顺序为A>C>D>B，即微波辅助时间对试验结果影响最大，乙醇浓度、料液比影响次之，微波功率影响最小。最佳提取工艺条件应为A2 B3 C2 D3因而，微波辅助波优选提取虎杖白藜芦醇的最佳工艺条件实际为：微波辅助作用时间15min，以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W。因最佳组合不在试验设计中，须做验证试验。

2.3 验证实验

为了验证优化计算结果的可靠性，选微波辅助作用时间15min以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W进行验证实验，平行做3组，计算得平均提取率为0.750%，虽然比试验中的最大提取率第4组只大一点，但由于微波功率的影响最小，所以在此条件下的确实确实优于其他条件，为最佳条件。

3 结语

（1）以70%乙醇水体系为白藜芦醇的提取溶剂，溶解度大，无毒而且溶剂回收容易，价格低廉对工业生产具有成本优势。（2）正交实验结果能验证单因素实验，各因素对白藜芦醇提取率影响程度大小依次为：微波辅助作用时间>乙醇浓度>料液比>微波辅助功率，同时能得到最佳的提取参数范围。在最佳提取参数范围取一组参数结果让人满意，最佳提取工艺参数为：微波辅助作用时间15min以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W，在该条件下，白藜芦醇的提取率为0.750%，关于虎杖中微波辅助提取白藜芦醇并测定其含量的报到相比，本实验方案采用的溶剂无毒、低成本、方法简单、检测采用分光光度法操作方便，且的到的提取率高，这是本文的独特之处。（3） 微波辅助波与传统的醇溶剂浸提法相比，操作时间明显缩短，能达到降低成本、省时、高效、节能、减少污染的目的。

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