CTE-RHA复合核酶抑制HCV RNA复制的研究
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【摘要】目的 建立HCV亚基因复制子稳定转染和表达的细胞株；探讨核酶和核酶-CTE复合物对HCV RNA的影响。方法 在脂质体介导下，经G418筛选抗性克隆，建立HCV 亚基因复制子稳定转染细胞系。用RT-PCR证实转染成功。观察四种核酶对HCV亚基因复制子稳定转染细胞中HCV RNA的影响。结果 两种复合核酶转染组扩增目的条带亮度明显低于对应普通核酶转染组。结论 新型复合核酶(带有CTE)在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。
【关键词】丙型肝炎 核酶 基因治疗
中图分类号：R394.8文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）3-060-03
丙型肝炎病毒是单股正链RNA病毒，是引起病毒性非甲非乙肝炎和输血后肝炎的重要病原体。核酶是一类能对特定序列的RNA进行切割、具有催化功能的小RNA分子。通过核酶技术抑制hcv的复制和表达已经成为近年来的研究热点。Warashina M等[3]报道将核酶联接到D型逆转录病毒的胞浆转运信号序列CTE(constitutive transport element)后，由于CTE具有解旋酶A（RHA）的结合序列，RHA能与CTE结合，使核酶能到达任何需要切割的位点。我们通过建立HCV亚基因复制子的稳定转染细胞株，并根据现有文献分别针对HCV 5-NCR序列最易（195位点）和最难（150位点）切割的位点设计相应的核酶和带有CTE的新型核酶，观察在细胞内各自对HCV rna的切割效率，比较各自对相应位点的切割效率以及新型核酶和普通核酶的切割效率有无差异，为丙肝的有效治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人肝细胞株QSG7701，PRC/CMV为空载体，PBM4-5 HCV，细菌JM109菌株由本实验室保存，DMEM高糖培养基（GIBCO公司），胎牛血清（四季青公司），G418筛选剂。
引物：β-actin(592bp)上游引物：5’-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’
下游引物：5’-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’由北京奥科生物科技公司合成
NS5A（314bp） 上游引物：5’-CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGT-3’
下游引物：5’-CGAGCTCATGATGCACGGTC-3’由长沙瑞晶生物公司合成
oligo(dT)18 由长沙瑞晶生物公司合成
1.2 稳定转染细胞的制备
分别将扩增后提取的质粒PBM4-5 HCV和空白质粒PRC/CMV转染QSG7701细胞，继续细胞培养，然后加入含筛选剂G418的正常培养基进行筛选，对细胞进行换液、消化传代1月，再对阳性克隆采取RT-PCR进行鉴定获得稳定表达HCV-RNA的QSG7701细胞。
1.3 核酶对QSG7701细胞中HCV RNA表达的影响
按照LipofectmineTM2000说明书中的转染程序，分别将新型核酶和普通核酶的四种质粒分别导入细胞。细胞分为七组：空白对照组1（不加质粒）、空白对照组2（转染空载体PRC/CMV）、转染PPHCV5-R1组、转染PPHCV5-R2组、转染PPHCV5-CR1组、转染PPHCV5-CR2组、阴性对照组（正常QSG7701细胞）。转染前一天，将适量细胞消化接种于6孔培养板，待细胞贴壁且密度达70％左右时进行转染，每孔用量：质粒DNA2ug + 脂质体6ul。转染48小时后取细胞进行下一步实验RT-PCR，观察各质粒对HCV RNA表达的影响。以β-actin为内参，观察各质粒对HCV RNA表达有无影响。
2 结果
2.1 稳定转染细胞组RT-PCR鉴定
图12 稳定转染细胞组RT-PCR鉴定
M：DNA Ladder；1：正常QSG7701细胞（作为阴性对照）；2：空白质粒转染组；3：目的质粒转染组；4：以质粒DNA为模板进行PCR组（作为PCR阳性对照）（各细胞组均以β-actin为内对照）
转染PBM4-5 HCV组细胞RNA经RT-PCR后可见大小为314bp的扩增片断，证实稳定转染成功，并说明在细胞内稳定表达HCV RNA，不能排除目的基因整合至宿主细胞基因组的可能，但这并不影响HCV RNA的表达，也不影响下一步试验；转染空白质粒组细胞RNA经RT-PCR后只可见592bp大小的β-actin扩增片断，无314bp大小的扩增片断，但细胞具有G418抗性并可稳定传代，由此推定空白质粒转染成功；正常QSG7701细胞组也只有592bp大小的β-actin扩增片断，提示RT-PCR结果可靠。
2.2 普通核酶和复合核酶对稳定转染的QSG7701细胞中HCV RNA的抑制作用
图15普通核酶和复合核酶对稳定转染的QSG7701细胞中HCV RNA的影响
M：DNA Ladder；1：正常QSG7701细胞（作为阴性对照）；2：pPHCV5-R2转染组；3：pPHCV5-CR2转染组；4：pPHCV5-R1转染组；5：pPHCV5-CR1转染组；6：空白质粒转染组（作阳性对照）
以β-actin为内参，pPHCV5-CR1（195位点）转染组未见扩增目的条带，而pPHCV5-R1转染组（195位点）可见浅扩增目的条带，提示带CTE的复合核酶能更加有效地切割HCV RNA；pPHCV5-R2（150位点）转染组与阳性对照组无明显区别，提示不带CTE的原核酶切割效果差，也可能与检测方法灵敏度有关；pPHCV5-CR2（150位点）转染组可见浅扩增目的条带，提示带CTE的复合核酶能够切割普通核酶无法切割的位点，切割效率明显高于普通核酶。
RT-PCR重复三次，相关分析数据见下表。
采用SPSS13.0统计软件，两组间计量资料采用t检验。
A组与E组相比较，t=12.8 ，P
B组与E组相比较，t=19.5 ，P
D组与E组相比较，t=21.4 ，P
以上三组与E组比较均具有统计学意义，提示核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-CR1和pPHCV5-CR2可在细胞内有效切割HCV 5-NCR序列。
C组与E组相比较，t=1.5 ，P=0.210 >0.05
C组与E组比较无统计学意义，可能由于RNA的二级结构掩盖pPHCV5-R2核酶的切割位点（150位点）致使pPHCV5-R2核酶无法完成切割，也可能与实验重复次数少、可用数据少有关。
A组与B组相比较，t=3.4 ，P=0.031
C组与D组相比较，t=16.7 ，P
以上两组比较具有统计学意义，提示两种复合核酶的切割效率均高于相对应的普通核酶。CTE具有解旋酶A（RHA）的结合序列，RHA能与CTE结合，使核酶能到达任何需要切割的位点，从而提高了核酶的切割效率。
A组与C组相比较，t=10.9，P
B组与D组相比较，t=5.7，P=0.005
以上两组比较具有统计学意义，提示HCV 5-NCR序列的195位点较150位点更易切割，可能是由于150位点正处于HCV 5-NCR二级结构的茎部和多环覆盖部，核酶难以到达切割位点发挥作用。
3 讨论
丙型肝炎病毒是肝炎病毒家族的重要成员之一，是引起病毒性非甲非乙肝炎和输血后肝炎的重要病原体，目前尚无非常有效的治疗方法。70%以上的感染者将发展成为慢性感染，部分将发展成肝硬化或肝癌。目前干扰素或干扰素联合病毒唑是治疗HCV感染的主要治疗手段，但仅30%左右病人有效。据WHO报告，世界上丙肝病毒感染者约1.7亿人，我国感染丙肝人数约在4000万以上(2003)，危害极大。
HCV基因组全长9.5kb，由编码区和5′末端及3′末端两个非编码区构成[1]。其中，NS5区最长，有3150个核苷酸，编码病毒的RNA依赖的RNA多聚酶，参与病毒复制[4]。NS5区分为NS5A和NS5B两区，NS5A区生物功能最为活跃，是目前的一个研究热点。NS5A基因具有多种生物学功能，参与多种蛋白的成熟和复制过程、细胞调控、病毒基因表达、细胞生长、凋亡以及免疫调节过程，还具有反式激活作用、预测干扰素疗效的作用。核酶是一类能对特定序列的RNA进行切割、具有催化功能的小RNA分子。Macejak DG[2]等针对HCV5′-非编码区15个保守序列位点设计核酶，并采用修饰基团进行修饰以延长核酶的半衰期、增加核酶的稳定性。研究发现：数个核酶可明显抑制HCV的复制，用针对195位点的核酶进一步研究显示抑制效应呈剂量依赖性，并具有序列特异性。
核酶的作用实际上受很多因素的影响[5]。其中，底物RNA的空间构型成为目前影响普通核酶在细胞内发挥作用的最为关键和最难控制的因素。Kuwabara T[6]等研究发现tRNA-核酶在胞浆的活性显著高于在胞核时的活性。Warashina M等[3]报道将核酶联接到D型逆转录病毒的胞浆转运信号序列CTE后，由于CTE具有RHA的结合序列，RHA能与CTE结合，使核酶能到达任何需要切割的位点。他们通过对结构复杂的HIV TAR基因RNA的研究发现，普通核酶不能切割的位点，带CTE-核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率比普通核酶明显提高。另外，CTE含有的胞浆转运信号能使核酶自由地由细胞核转运至细胞浆，使核酶能有效地与分布于细胞浆的底物RNA接触，进一步提高核酶的使用效率。
本实验根据Macejak DG等[2]的报告，1b型丙型肝炎病毒cDNA5-NCR序列的195位点是核酶最易切割的位点。根据Ali N[7]报告的HCV 5-NCR二级结构推测150位点是核酶最难到达的位点，分别根据这两个位点的序列设计选择已构建的普通核酶和带有CTE的新型核酶，针对195位点的普通核酶pPHCV5-R1和新型复合核酶pPHCV5-CR1以及针对150位点的新型复合核酶pPHCV5-CR2均可在细胞内有效切割HCV 5-NCR序列。针对150位点的普通核酶pPHCV5-R2不能有效切割目标RNA，这可能是由于RNA的二级结构掩盖pPHCV5-R2核酶的切割位点（150位点）致使pPHCV5-R2核酶无法完成切割。结果还显示新型复合核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2的切割效率均高于相对应的普通核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2，这可能与CTE具有解旋酶A（RHA）的结合序列，与RHA结合后，使核酶能到达任何需要切割的位点，从而提高了核酶的切割效率有关，研究结果与Warashina M等人的结论一致。新型核酶在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，CTE介导的核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，CTE介导的核酶的切割效率明显提高。为核酶在抑制HCV的研究领域中提供新的思路和方向。
参考文献
[1] Choo QL, KH Richman, JH Han, et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991,88:2451-2455.
[2]Macejak DG, Jensen KL, Jamison SF,et al. Inhibition of hepatitis C virus (HCV)-RNA-dependent translation and replication of a chimeric HCV poliovirus using synthetic stabilized ribozymes. Hepatology. 2000,3;31(3):769-776.
[3]Warashina M, Kuwabara T, Kato Y,et al. RNA-protein hybrid ribozymes that efficiently cleave any mRNA independently of the structure of the target RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 5(8);98(10):5572-5577.
[4] Van Doorn LJ. Molecular biology of the hepatitis C virus. J Med Virol.1994； 43：345-456.
[5] Santoro SW，Joyce GF. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme [J] . Proc NatlAcad Sci USA，1997，94 (8)：4262 - 4266.
[6]Kuwabara T, Warashina M, Koseki S,et al. Significantly higher activity of a cytoplasmic hammerhead ribozyme than a corresponding nuclear counterpart: engineered tRNAs with an extended 3' end can be exported efficiently and specifically to the cytoplasm in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2001,7(1);29(13):2780-2788.
[7]Ali N, Siddiqui A. The La antigen binds 5' noncoding region of the hepatitis C virus RNA in the context of the initiator AUG codon and stimulates internal ribosome entry site-mediated translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 3(18);94(6):2249-2254.