铁皮石斛Ty1copia类反转录转座子反转录酶(RT)序列的克隆与分析
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[摘要]该研究根据Ty1-copia类反转录转座子RT的通用引物，从铁皮石斛浙江临安（C15）和云南广南（A39）种质中扩增得到43条Ty1-copia类反转录转座子RT序列，这些核苷酸序列具有较高的异质性，主要表现为，序列长度变化范围 260～266 bp，终止密码子和移码突变，所有序列均富含碱基AT，一致性为 47.1%～97.7%。经plantCARE软件分析发现受低温、热、光、各种植物生长调节物质等不同胁迫条件作用的调控元件、多个启动子的特征结构TATA box和CAAT box的保守序列及其他一些调控元件。翻译成氨基酸后，有10条序列出现1～4个不同程度的终止密码子突变，5条序列出现移码突变，保守序列“SLYGKQ”发生变异的有 39条序列。其氨基酸序列经过系统聚类后可分为6类；且与其他植物（尤其是单子叶植物的小麦、荸荠）具有较高的同源性，表明它们间可能存在着Ty1-copia 反转录转座子的横向传递。
[关键词]铁皮石斛；Ty1-copia类反转录转座子；反转录酶（rt）；异质性
[收稿日期]2013-07-26
[基金项目]浙江省重大科技专项（2012C12912，2011C12002）
[通信作者]高燕会，副教授，主要从事植物生物技术和品种选育研究，E-mail：
[作者简介]李聪，硕士研究生，E-mail：
反转录转座子（retrotransposon或retroposon）指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件，包括长末端重复（long terminal repeat，LTR）反转录转座子和非长末端重复（non-long terminal repeat，non-LTR） 反转录转座子两类，而Ty1-copia类反转录转座子是LTR反转录转座子的一种，从单细胞的藻类到裸子植物和被子植物都存在[1-2]。转座子广泛分布于整个基因组，导致基因组多样性的原因主要有2个：转座作用，即由于反转录转座子在基因组中的复制与转座造成了基因组的多样性；反转录转座子之间或其LTR之间的同源重组[3] 。反转录转座子不仅在很大程度上影响着植物基因组多样性而且与植物进化有着密切的关系，有可能成为植物种属间进化、分化的证据[4]。例如，仅反转录转座子RIREI就造成了普通水稻Oryza sativa和澳洲野生稻O. australiensis基因组间差异的1/3[5]。玉米与高粱分化之后，玉米基因组内逆转座子的大量积累造成了两者基因组间的显著差异[6]。另外，LTR类反转录转座子的转录活性还受环境条件的调节，许多反转录转座子的转录可以被多种生物的和非生物的胁迫所激活[7]。因此，反转录转座子对基因组的类型、结构、表达、调控与进化方面都有重要的作用，近年来已成为研究生物多样性与系统进化、遗传连锁图谱建立、基因标签、基因功能分析、生物多样性及系统发育进化研究的重要工具[8-9]。
铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是传统名贵珍稀中药材，被列为“中华九大仙草之首”，研究表明具有益胃生津、滋阴清热等独特功效[10]。在长期进化过程中，铁皮石斛种内和种间形成了丰富的遗传多样性[11-12]。为了探讨铁皮石斛基因组的遗传多样性和进化关系以及对逆境胁迫的反应机制，本研究以铁皮石斛浙江临安野生种质（C15）、云南广南（A39）为材料，克隆Ty1-copia类反转录转座子的RT基因片段并分析RT序列的异质性特点，试图为铁皮石斛的基因组进化和遗传多样性的研究提供依据，并为进一步研究反转录转座子在铁皮石斛对逆境反应机制的研究提供基础。
1材料
供试材料铁皮石斛C15具有较强的抗寒能力，原产于铁皮石斛分布的北缘浙江临安（119°12′E，30°31′N），A39抗寒较差，分布于铁皮石斛分布的南缘云南广南（04°31′E，23°29′N）。经浙江农林大学天然药物研发中心斯金平教授鉴定为铁皮石斛D. officinale，用其茎段在浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地组培室组织培养（生长期 240 d，光周期 16 h・d-1，温度 25 ℃）后供DNA提取。
DNA Ex Taq酶，MgCl2，10×buffer，dNTPs和克隆载体pMD18-T Vector均购自TaKaRa公司；克隆用大肠杆菌DH5α为本实验室保存；凝胶回收试剂盒购自XYGEN生物技术（杭州）有限公司；引物由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
2方法
2.1铁皮石斛DNA的提取
铁皮石斛基因组 DNA 提取方法参照赵瑞强等[13]改良CTAB方法，提取的DNA纯度和浓度用紫外分光光度计（NANODROP 2000， Thermo）检测，完整性用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，于-20 ℃冰箱备用。
2.2反转录酶序列的PCR 扩增
根据Kumar等[14]针对Ty1-copia类LTR反转录转座子RT序列设计的简并引物对Ty1-F（5′-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3′）和Ty1-R（5′-ARCATRTCRTCNACRTA-3′），由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
PCR反应体系（20 μL）：包括：10×Buffer；1.5 mmol・L-1 Mg2 +；0.1 mmol・L-1 dNTPs；0.4 μmol・L-1引物（Ty1-F，Ty1-R）；0.5 U Taq酶； DNA模板30 mg・ L-1。PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性1 min，35个循环（94 ℃变性1 min，46.5 ℃退火1.45 min，72 ℃延伸1 min），72 ℃延伸5 min。
2.3PCR 产物回收、克隆及测序
用1%琼脂糖凝胶检测扩增产物，并用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产物，直接将回收产物连接于pMD18-T 载体（TaKaRa公司）上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃培养12～16 h进行蓝白斑筛选，挑取白色克隆于含有50 mg・L-1氨苄青霉素的LB液体培养基中培养4～6 h后，PCR鉴定阳性克隆的菌液，于上海生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
2.4反转录酶序列分析
测序结果通过NCBI中BLAST程序进行同源性比对，采用Clustal X软件进行多重比对，用MEGA 5.0软件邻接法构建系统发育进化树。
3结果与分析
3.1反转录酶（RT）序列PCR 扩增及测序
供试材料C15和A39中都检测到了反转录酶序列，长度均为 260 bp左右（图1），这与在其他植物上的研究报道一致[15-16]，说明供试材料C15和A39都有一致的目的扩增产物，初步证明了RT基因片段在铁皮石斛中广泛存在。
M.Marker；1～3.A39 3个平行；4～6.C15 3个平行。
图1铁皮石斛反转录转座子反转录酶序列的PCR 扩增
Fig.1PCR amplification of reverse transcriptase sequence from Dendrobium officinale
将2个样品的特征片段回收、克隆并测序，共获得89条序列，经Blast比对和DNAstar分析后，去除重复与过短序列获得43条不同的序列，其中有21条来自C15（C15-1～C15-21），22条来自A39（A39-1～A39-22）。
3.2Ty1-copia类反转录酶的异质性及序列分析
3.2.1Ty1-copia 类反转录酶的核苷酸序列比较将获得的43条序列于NCBI数据库进行序列比对，结果表明它们均与已知植物Ty1-copia类反转录转座子的RT序列有很高的相似性，所测得的序列大小均在260～266 bp（表1），这与预期片段大小一致。所有序列均富含碱基AT，利用MEGA5.0 软件计算出所有序列AT/GC比值范围为1.1～1.92（表2）；通过DNAMAN软件计算出核苷酸序列一致性范围为47.1%～97.7%，其中序列A39-8与C15-14，C15-2与A39-16的一致性最高，均为97.7%，序列A39-5与A39-1的一致性最低，仅为47.1%。由此可见，由同一简并引物获得的反转录转座子RT序列并不完全一致，在长度、碱基变化上的多态性折射出铁皮石斛同一类反转录转座子的高度异质性，这是因为类似于病毒的复制，反转录转座子在转座过程中由于缺乏自动校正的机制， 致使RT序列会出现碱基错配、丢失、移码等突变，从而呈现出高度异质性[17]。
表1铁皮石斛Ty1-copia 类反转录酶序列的组成
Table 1The nucleotide composition of reverse transcriptase of Ty1-copia retrotransposons in Dendrobium officinale
表2铁皮石斛Ty1-copia类反转录酶序列转录因子结合位点与调控元件的数目
Table 2The number of transcription factor binding sites and regulatory elements of Ty1-copia retrotransposons in Dendrobium officinale
Tyl-copia类反转录转座子是DNA-RNA-DNA的转座元件，转录是其转座活性表达的必要步骤，在其LTRs中存在着转录起始与终止的信号以及与诱导表达相关的调控元件[18]。植物中Ty1-copia类反转录转座子的转录活性正常条件下并不表达，但能被多种胁迫条件所激活，这是反转录转座子在长期进化过程中模仿寄主基因胁迫表达的结果[7]，因而反转录转座子的转录活性能被各种胁迫条件所激活[19-21]。利用软件plantCARE分析获得的43条序列，发现铁皮石斛Tyl-copia RT序列中存在受低温、热、光、各种植物生长调节物质等不同胁迫条件作用的调控元件、多个启动子的特征结构TATA box和CAAT box的保守序列及其他一些调控元件（表2）。这可能是长期进化过程中反转录转座子对寄主启动子表达方式不断适应的结果。
3.2.2Ty1-copia 类反转录转座子的RT氨基酸序列比较克隆的43条序列中，不具有内含子序列，翻译成氨基酸后大多都包含TAFLHG和下游YVDDM 2个基序（图2），参照Ty1-copia类反转录转座子RT基因的氨基酸保守序列，发现有5条序列发生了移码突变，分别是C15-9（第53个氨基酸处），C15-1（第76个氨基酸处），A39-10（第76个氨基酸处），A39-17（第76个氨基酸处）和A39-5（第76个氨基酸处）；有9条序列，即C15-2，C15-3，C15-6，C15-11，A39-1，A39-5，A39-6，A39-9，A39-12，A39-16，发生了终止密码子突变，其中C15-3和A39-5分别发生了多达4个和3个终止密码子的突变，A39-6发生了2个终止密码子突变，其余序列均发生一个终止密码子突变。因此推断，移码突变和终止密码子突变可能是导致铁皮石斛反转录转座子异质性的重要原因之一。
保守序列“SLYGKQ”[22]（第35～41个氨基酸）发生变异的有39条序列，只有4条序列未发生变异，大多数是“SLYGKQ”中的“S”被“A”所替代（图2），保守序列中存在碱基替代突变是否会影响逆转录酶的功能有待进一步验证，例如，水稻中Ty1-copia类逆转座子Tos17的转座活性受组织培养条件诱导，但其“SLYGKQ”中的“S”被“A”所替代，这种碱基替代突变并未改变Tos17的转录与转座活性[23]。
应用软件Clustal X对序列进行比对，4种不同程度的阴影部分表示序列的保守程度（黑色部分保守性为100%；深灰色部分保守性为75%；浅灰色部分保守性为50%；没有阴形部分保守性为小于50%）；X.终止密码子；・表示优化联配产生的缺口；右边的数字表示序列中氨基酸的数量。
图2铁皮石斛Ty1-copia反转录转座子RT基因氨基酸序列比较
Fig.2The amino sequence alignment of reverse transcriptase of Ty1-copia retrotransposons in Dendrobium officinale
3.3铁皮石斛Ty1组反转录转座子RT序列的系统发育进化树分析
利用MEGA5.0软件邻接法将所得的铁皮石斛43条Ty1-copia类反转录转座子RT氨基酸序列构建了相应的系统发育进化树（图3），根据进化树branch 的长度可把这43条反转录酶序列分成了6类。其中Ⅰ类包含了20个序列，Ⅱ类包含了5个序列，Ⅲ类包含了6个序列，Ⅳ类包含了6个序列，Ⅴ类包含了2个序列，Ⅵ类包含了4个序列。其中第Ⅵ类中4条序列含有88个氨基酸，而其他序列均为87个氨基酸。来自C15的C15-1～C15-21序列与A39的A39-1～A39-22序列在聚类图上混在一起，不能明显分开。
经过与木本、草本（单子叶和双子叶植物）等生物体内的Ty1-copia类反转录酶的氨基酸序列的进化分析，表明铁皮石斛与单子叶植物的小麦和荸荠的Ty1-copia类反转录转座子的RT氨基酸序列同源性较高，因反转录转座子在植物界广泛分布，作为基因组的重要组成部分，不仅可以纵向传递，而且可以横向传递[24]，由此可以推断，铁皮石斛反转录转座子的进化过程中发生了横向传递作用。
4结论与讨论
本研究中首次利用Ty1-copia类反转录转座子RT的通用简并引物从浙江临安（C15）和云南广南（A39）种质中克隆到铁皮石斛Ty1-copia类反转录转座子RT基因序列，序列长度变化范围为260～266 bp，与在其他植物上的报道[15-16]一致，说明该类反转录转座子在铁皮石斛中普遍存在，且序列长度比较相似，具有一定的保守性，证实采用通用简并引物的方法分离Ty1-copia类反转录转座子的方法是可行的。
本研究选用原产铁皮石斛分布北缘的C15和原产铁皮石斛分布南缘A39为材料，考察Ty1-copia类反转录转座子反转录酶序列在两者中是否有差异，经相关软件分析后，分别得到21条和22条独立克隆，从核苷酸和氨基酸序列的分析结果来看，2种供试材料无明显的差异，可以推测地域差异可能对Ty1-copia类反转录转座子RT序列的影响不大。各反转录酶序列在长度、碱基同源性、碱基变化上存在较大的异质性，经序列特征分析表明缺失突变、移码突变以及终止密码子突变可能是造成铁皮石斛反转录转座子异质性的重要原因，这与杜晓云等[25]和Woodrow等[26]在其他植物中的研究结果一致。经plantCARE分析铁皮石斛43条序列含有低温、热、光、各种植物生长调节物质等不同胁迫条件作用相关的调控元件、多个启动子的特征结构TATA box和CAAT box的保守序列及其他一些调控元件，它们功能还有待进一步试验验证。
对43条铁皮石斛Ty1-copia类反转录转座子RT列的系统聚类分析可分为6类（图3），不同类别里含有的反转录酶序列数量不同，反映了不同家族反转录转座子的转录过程存在差异，其存在的历史地位也可能不同[27]，对铁皮石斛基因组进化的作用也可能各异。经与其他植物反转录酶的氨基酸比较分析，铁皮石斛Ty1-copia类反转录酶与小麦、荸荠同源性较高，证明是反转录转座子在物种间横向传递的结果[28]。研究结果为铁皮石斛的基因组进化和遗传多样性的研究提供了依据，并为进一步研究反转录转座子在铁皮石斛对逆境反应机制的研究提供了新信息。
树枝长度代表以邻接法估算出来的遗传距离。
图3铁皮石斛Ty1-copia反转录转座子反转录酶氨基酸序列进化树
Fig.3Phylogenetic tree of amino sequences of reverse transcriptase of Ty1-copia retrotransposons in Dendrobium officinale
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Cloning and analysis of reverse transcriptase（RT） of Ty1-copia
retrotransposons in Dendrobium officinale
LI Cong， SI Jin-ping， GAO Yan-hui*， ZHU Yu-qiu
（Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang Agricultural and
Forestry University， Zhejiang Provincial Strategic Alliance for Technical Innovation in Industry of
Dendrobium officinale， Lin′an 311300， China）
[Abstract]Using universal primer Ty1-copia retrotransposon RT，43 Ty1-copia like retrotransposon RT with high heterogeneity， stop codon mutation and frameshift mutation were amplified by PCR from genomic DNA of Zhejiang Lin′an （C15） and Yunnan Guangnan （A39） of Dendrobium officinale. The length of these sequences varied from 260 to 266 bp， and was rich in AT and consistency ranged from 47.1% to 97.7%. Different c/s-acting regulatory elements induced by low temperature， heat， light， all kinds of plant growth regulating substances and the starting transcription signals， corresponding to CAAT box， TATA box conserved sequences and some other regulatory elements. When being translated into amino acids， ten sequences presented stop codon mutation， five sequences presented frameshift mutation， and thirty-seven sequences presented conserved sequence "SLYGKQ" mutation. Six categories were identified through phylogenic analysis after alignment analyses of their amino acid sequences， and with other plants （eg. Triticum aestivum， Eleocharis quinqueflora） having high homology， which indicated that horizontal transmission of retrotransposon occurred among the plants in the past.
[Key words]Dendrobium officinale； Ty1-copia-like retrotransposon； reverse transcriptase（RT）； heterogeneity
doi：10.4268/cjcmm20140210