SELDI-TOF-MS技术在临床诊断中的应用

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摘 要:表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface-enhanced laserdesorption/inionation-time of flight-mass spectra,seldi-tof-ms)为蛋白质组学研究提供了最为有效的技术平台。它将芯片技术和飞行时间质谱技术相结合,整合样品分离、纯化及检测分析为一体,实现了快速、高效、高通量检测,是在分子水平上诊断疾病的非常重要的工具。

关键词:SELDI-TOF-MS;蛋白质组学;诊断

中图分类号:R2-03 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0051-03

Application of SELDI-TOF-MS in Clinical Diagnosis

LIU Chibo,LIANG Yong,CHEN Jinguang,PAN Chunqin,YAN Dongliang,WANG Haibao,ZHOU Kaiyu

(Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000,Zhejiang,China)

Abstract:The technique of surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) provides the most effective platform for research of proteomics. SELDI-TOF-MS, which combine the technologies of proteinchip with time of flight-mass spectra and integrate separation, purification, analysis of sample and realize rapid, high performance and high throughput detection, is an extremely important tool for diagnosis of disease at the molecular level.

Key words:SELDI-TOF-MS; proteomics; diagnosis

蛋白质组学(proteomics)技术是后基因组时代的一重要研究工具,在生命科学领域中发挥重要作用。蛋白质组学是通过对不同时间和空间发挥特定功能的蛋白质群体进行研究,阐明生物体全部蛋白质的表达和功能模式,包括鉴定蛋白质表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能及相互作用方式等,从机体或细胞的蛋白质整体活动来揭示生命规律。而SELID蛋白质芯片技术是近几年发展起来的一个新的蛋白质组学技术。严格来说,SELDI技术是一种“比较”技术,也是在现有蛋白质组学技术中唯一在检测样本数量和每个样本中蛋白质数量两方面达到高通量的技术。在过去几年中,随着仪器性能和相关技术方法的改进和探索,应用SELDI蛋白质芯片技术对肿瘤标志蛋白的研究获得广泛和迅猛发展。2004年以来,该技术在美国已被列入人类蛋白质组计划主要推荐技术之一。我国已有20余个单位开展此项研究。以下对SELDI质谱技术的基本原理、优点及在临床诊断中的应用前景进行综述。

1 SELDI-TOF-MS原理

SELDI-TOF-MS技术结合了蛋白芯片和生物质谱技术,是继基因芯片之后出现的新一代生物芯片技术。该芯片设计的基本原理是:首先用生物或化学方法在载体表面制成点状芯池,再点入待检的生物样品,其中的蛋白分子通过其自身的生物或理化性质(亲水性、疏水性、金属络合及离子作用等)与芯片相结合,从而实现捕获、保留和纯化与之特异性结合的蛋白分子。接着用缓冲液洗脱未结合或非特异性结合的分子后再用激光脉冲进行轰击,即释放出靶点上的特异性蛋白分子。不同质荷比(m/z)的离子在电场中飞行的时间长短不一,分子量越大的离子在电场中飞行的时间越长,反之则越短。最后通过生物质谱(TOF-MS)即可绘制出一张质谱图。该图经分析软件处理后还可形成模拟谱图,用于更直观地显示样品中各种蛋白质的相对分子质量、含量及磷酸化位点等信息。蛋白质芯片根据表面物质的不同,可将其划分为化学型和生物型两类。化学型芯片通过化学作用结合样品中的蛋白质,并根据其作用原理的不同又可进一步细分为疏水性芯片、亲水性芯片、阳离子芯片、阴离子芯片和金属亲和芯片等类型;生物型芯片则是把生物活性分子,如抗体、酶、受体、DNA等结合到芯片表面,借助抗原-抗体、酶-底物、受体-配体、蛋白质-DNA等相互作用结合样品中的蛋白质。生物芯片特异性高,还可以进行蛋白质定量。

2 SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术的优点

相比传统蛋白质组技术,如二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)、电喷雾质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS)技术,SELDI蛋白质芯片技术的优势在于:①可分析2D-PAGE无法分析的蛋白质,包括疏水性蛋白质,低分子量(

3 SELDI-TOF-MS技术在临床诊断中的应用

3.1 在肿瘤特异性标志物的筛选中的应用

3.1.1乳腺癌 Li等[1]用SELDI-TOF-MS技术及配套蛋白质芯片检测49例乳腺癌和37例非乳腺癌疾病患者的血清蛋白质指纹图谱,并运用SPSS 10.0软件判别分析处理数据和筛选标志物,建立了3个诊断模型。组合构建的诊断模型Ⅰ包括6个蛋白质峰,质荷比分别为8611、16827、25711、28931、25485和2437,鉴别乳腺癌和非乳腺癌疾病的敏感性为81.6%,特异性为78.4%。组合的诊断模型Ⅱ也包括6个蛋白质峰,其质荷比分别为4470、10854、19193、3883、2011和7470,鉴别Ⅰ期乳腺癌与非乳腺癌疾病的敏感性为80.0%,特异性为89.2%。组合的诊断模型Ⅲ包括5个蛋白质峰,其质荷比分别为2726、27014、2247、4477和19333,鉴别Ⅰ期与Ⅱ～Ⅳ期乳腺癌的敏感性为91.2%,特异性为93.3%。Ricolleaun[2]等采用SELDI-TOF-MS技术分析了30例非结节性无再发乳腺癌患者和30例发生转移性再发患者的病理标本,发现多达72个峰,其中两个被证明是泛肽和铁蛋白轻链(FLC)。进一步研究表明,细胞溶质的泛肽水平增高和(或)FLC的水平下降可以很好地预示乳腺癌。

3.1.2胃癌 Liang等[3]在胃癌方面检测了33例胃腺癌患者和31例健康者的血清蛋白质组,建立了质荷比分别为5910、5084、6640和8691的差异蛋白峰的胃癌特征性蛋白质波谱模型,用该模型检测的灵敏度为90.91%(30/33),特异性为93.55%(29/31),阳性预测值为93.75%(30/32)。Melle等[4]对74份包括胃癌组织、癌旁组织及正常胃上皮的冰冻切片进行分析,发现了一个在癌组织中明显下调的蛋白,免疫组化鉴定为胃蛋白酶(原)C(pepsinogen c)。高春芳等[5]研究发现胃癌患者与正常人在质荷比为1723～14048间有18种血清蛋白质含量有显著差异,其中质荷比为2786、2878、3170、13872、5257的5种蛋白质组成的生物标志物可将正常人与胃癌患者准确地分组,其敏感性与特异性均高于用CEA诊断胃癌。Qian等[6]利用 SELDI-TOF-MS技术及生物标记软件(BPS)发现了血清中16个有统计学意义的蛋白质峰,其中9个峰在胃癌患者中高表达。经过BPS分析,其中两个峰组成的肿瘤标记物模型在诊断的敏感性、特异性及准确性均高于目前临床上的血清标记物CEA、CA19-9和 CA72-4,尤其研究中的所有I/II期胃癌患者均被正确识别,但该诊断模型的临床意义仍需大规模的研究来验证。刘池波等[7]利用SELDI技术发现胃癌患者中一簇质荷比在11.1～11.9KD的蛋白峰明显高于健康者,经蛋白质组学技术鉴定该簇蛋白为血清淀粉样蛋白A,可用于胃癌患者的早期诊断、疗效观察。

3.1.3 前列腺癌 Pant等[8]使用SELDI-TOF-MS技术。对83例前列腺癌 (PCA)患者和95例健康人血清标本进行了检测比较。在PCA患者血清中有4种蛋白表达水平升高,8种蛋白表达水平降低,出现了18个潜在的生物标记。选择其中8个蛋白标记通过建立的五层决策树分类系统鉴别诊断PCA和健康人,特异性为92.6%,敏感性为96.4%。Adamt等[9]为了寻找PCA特异蛋白标记物,设定了3组研究对象(PCA患者167例,良性前列腺增生患者77例,年龄匹配健康男性82例),使用SELDI-TOF-MS进行血清检测,在PCA患者中发现9个蛋白质峰与正常人及前列腺增生患者不同。以检测到的9个蛋白质峰为分析依据,结果肿瘤组检测敏感性为83%,对照组特异性为97%,对试验组的阳性预测值为96%,合并试验组分析(PCA和非癌组)的阳性预测值为9l%。研究者认为,SELDI-TOF-MS和五层决策树分类系统对于PCA的早期诊断是一种高准确性和创新性的方法。

3.1.4肝癌 Wang[10]等将106份血清样本(包括52例肝细胞癌患者、22例肝硬化患者和32例健康志愿受试者血清)随机分成两组。训练组包括35例肝细胞癌患者、14例肝硬化患者和。21例健康受试者血清,用以建立人工神经网络(ANN)模型;试验组包括17例肝细胞癌患者、8例肝硬化患者和11例健康受试者血清。采用SELDI-TOF-MS技术对训练组56例样本(35例肝细胞癌患者、21例健康受试者血清)分析后获得241个蛋白质峰,其中21个峰用于肝细胞癌和正常对照比较(P

3.2在男性不育相关领域疾病研究方面的应用

杨欢等[11]利用H4、SAX2等芯片鉴定出几个在少精症患者异的生物标志物,如在H4芯片上,少精症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱比较,有1处蛋白质峰明显增高,其相对分子质量为11507.4,有1处蛋白质峰明显降低,其相对分子质量为11022.9,在SAX2蛋白质芯片上,少精症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱相比有1处蛋白质峰明显增高,其相对分子质量为16751.6。由此,可根据患者精浆中的差异蛋白含量可来帮助鉴定是否患有少症。白洁等[12]利用CM10芯片通过无症组与正常组比较有28种蛋白质表达存在差异,差异的蛋白质中有24种含量低于正常组,其中4个M/Z在7 196.058、7 630.573、7 547.610和7 709.833的蛋白质差异极显著(P

3.3在膝骨性关节炎不同中医证型领域研究中的应用

王海宝[13]应用CM10蛋白芯片分析了30例肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者、35例气滞血瘀型膝骨性关节炎患者血清和40例健康着血清的蛋白指纹图谱,获得的蛋白质谱采用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析。结果发现肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者与健康者血清蛋白质谱相比有18个显著差异蛋白质(P

4展 望

蛋白质芯片技术是近年来兴起的的一种蛋白质组学研究的新方法,以质谱分析替代传统的免疫诊断也是一种新出现的疾病诊断模式,以SELDI质谱蛋白质芯片技术为寻找疾病标志物建立了一个良好的技术平台,其快速、高通量、准确的特点已经被广泛的认同。随着这项技术逐渐推向临床,也发现这项技术尚待完善,如差异蛋白的在线鉴定问题;如图谱中的峰高和蛋白质浓度之间的关系并非都是线性的;不同的研究者,由于检测过程中诸多因素的控制不一,对同种疾病得到的具有区分作用的峰是有差异的。所以 SELDI-TOF-MS要全面应用于临床研究,还需要在标准化、定性等问题上深入研究,在今后的实践过程中还有很多的问题需要解决,但SELDI-TOF-MS技术必将成为快速诊断、发现并鉴定肿瘤标志物的有效手段。

参考文献

[1] Li J N,Zhang Z,Rosenzweig J,et al. Proteomics and Bioinformatics Approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer[J]. Clinical Chemistry,2002,48:1296-1304.

[2] Ricolleau G,Charbonnel C,Lodel,et al.Surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry protein profiling identifies ubiquitin and ferritin light chain as prognostic biomarkers in node-negative breast cancer tumor[J].Proteomics, 2006,6(6):1963.

[3] Liang Y,Fang M R,Li J C,et al. Serum proteomic patterns for gastric lesions as revealed by SELDI mass spectrometry[J].Experimental and Molecular Pathology,2006,81(2): 176-180.

[4] Melle C,Ernst G,Schimmel B,et a1.Characterization of pepsinogen C as a potential biomarker for gastric cancer using a his-to-proteomic approach[J].J Proteome Res,2005,4:1799-1804.

[5] 高春芳,李冬晖,赵光,等.胃癌患者血清比较蛋白质组学研究[J].医学杂志,2005,30:457-459.

[6] Qian HG,Shen J,Ma H,et a1. Preliminary study on proteomics of gastric carcinoma and its clinical significance[J].World J Gastroentero1,2005,20(15):6249-6253.

[7] 刘池波,梁勇,王海宝,等.胃癌患者中血清淀粉样蛋白A的测定及临床意义[J].中华胃肠外科杂志,2009,12(3):314-315.

[8] Pan YZ,Xiao XY,Zhao D,et al.Proteomic analysis of prostate cancer using surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry[J]. Chin Med,2005,85(45):3172-3178.

[9] Adam BL,Qu Y,Davis JW,et al.serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benigh prostate hyperplasia and healthy men[J].Cancer Res,2002, 62(13):3609-3614.

[10] Wang JX,Zhang B,Yu JK,et al.Application of serum protein fingerprinting coupled with artificial neural network model in diagnosis of hepatocellular carcinoma[J].Chin Med, 2005,11(15): 1278- 1284.

[11] 杨欢,张杰,张炜,等.利用H4和SAX2蛋白质芯片技术筛查少精症患者精浆标志物[J].中华男科学杂志,2006,12(1):39-42.

[12] 白洁,孙玲,陈士岭,等.无症患者与生育男性精浆蛋白质群的比较分析[J].中华男科学杂志,2007,13(7):446-448.

[13] 王海宝.用蛋白芯片技术筛选膝骨性关节炎不同中医证型患者血清中标志蛋白[J].中华中医药学刊,2009,27(5):934-936.